Молекулярный фишинг на чипе оптического биосенсора

используется для количественных измерений ББВ.
SPR позволяет регистрировать ББВ в реальном

времени в виде сенсограмм .

взаимодействий — константу диссоциации комплекса и аффинность
кинетические параметры —

константы скоростей образования и распада белковых комплексов

Анализ серии сенсограмм, полученных при разных температурах:
термодинамические характеристики — изменение свободной энергии Гиббса (ΔG), изменение энтальпии (ΔH) и энтропии (ΔS)

нековалентная
иммобилизации иммобилизация
лигандов лигандов

реагент, на который нековалентно иммобилизируется лиганд (рис. б). В качестве

такой аффинной связки могут выступать специфические моно- или поликлональные антитела, стрептавидин .
Распространен метод иммобилизации белков лигандов, содержащих так называемый гистаг (метку в виде последовательности из 6 гистидинов, 6×His). Белки иммобилизуются на оптическом чипе, поверхность которого модифицирована соединением NTA (нитрилотриацетат), за счет образования трех хелатных комплексов, состоящих из двух остатков гистидина, одного иона никеля (Ni2+) и одной молекулы NTA (рис. в)

совместно с масс-спектрометрической идентификацией.

Идентификация белковых последовательностей при помощи комбинации высокопроизводительных

методов разделения белков и их масс-спектрометрического анализа является ключевым этапом протеомного анализа.

платформах:
Использование двумерного электрофореза в комбинации с идентификацией белков методом

MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Использование одномерного электрофореза в полиакриламидном геле в комбинации с обращенно-фазовой жидкостной хроматографией, совмещенной с тандемной масс-спектрометрической детекцией.
Использование безгелевой технологии MudPit при помощи многомерного хроматографического разделения белков с последующим масс-спектрометрическим анализом

заряда и массы.
Для визуализации белковых молекул используют различные методы их

окрашивания - методы серебрения, окраски Кумасси голубым и флуоресцентные красители.
Для изучения белковых комплексов используется нативный (неденатурирующий) 2DE или голубой нативный 2DE.
Для осуществления идентификации представленные на электрофореграмме в виде пятен белки вырезают, и затем проводят ферментативное расщепление белка в пятне с использованием трипсина.

Полученный гидролизат анализируют при помощи массспектрометрии.
Идентификация белков по полученным масс-спектрам пептидных фрагментов проводится с использованием баз данных белковых и нуклеотидных последовательностей.

гидролизу в геле.
Затем экстрагированные пептиды анализируют с использованием масс-спектрометрических подходов.

клеток.
Этапы: - гидролиз белков в смеси

- первое направление разделения пептидов