БИОТЕХНОЛОГИЯ

А.И. Герцена

Направление 020400 Биология
Профиль Общая биология






Профессор кафедры Зоологии д.б.н., проф. Цымбаленко Надежда Васильевна

БИБЛИОТЕКИ ГЕНОВ

белки (структурные гены) – цель очень многих биотехнологических экспериментов.
Создание

геномной библиотеки (библиотеки генов, банка клонов, банка генов)- процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введение этих элементов в клетки-хозяева.
Полная библиотека по определению содержит весь геном данного организма.
Специфика структурной организации генов прокариот и эукариот инициирует разработку и применение различной стратегии для их клонирования.

суммарной хромосомной ДНК.
Алгоритм:
суммарную ДНК гидролизуют РЭ и каждый из

полученных фрагментов встраивают в вектор
проводят поиск специфической клеточной линии (клона), которая содержит нужную последовательность
выделяют ДНК и анализируют

рестриктазой типа II
Один из способов создания библиотеки ДНК состоит в

обработке донорной ДНК рестриктазой, узнающей тетрануклеотиды, например, Sau3AI, которая вносит один разрыв примерно на 256 пар оснований. Гидролиз проводят в таких условиях, чтобы происходило лишь частичное расщепление, так что образуются фрагменты различных размеров.
Глубину гидролиза обычно контролируют изменением времени инкубации или количества фермента. Одни молекулы, представленные на рисунке, расщеплены по всем сайтам для рестриктазы (REI-сайтам), другие только по некоторым

рестриктазой типа II

на основе ДНК λ-фага

несущего искомую последовательность ДНК. Для этого используют три широко известных

метода:

гибридизацию с меченым ДНК-зондом с последующей визуализацией отобранных образцов (изотопная и неизотопная)

иммунологический скрининг

скрининг по активности белка, кодируемого геном-мишенью

только трансформированных клеток.
Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую

подложку (например, нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр), так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чашке.
Клетки лизируют, высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и депротеинизации и фиксируют на фильтре.
На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию.
Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят детекцию, чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд.
Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают из них материал и культивируют.

комплементарными полинуклеотидными цепями, в результате которого образуются гибриды ДНК-ДНК
либо

ДНК-РНК, называется гибридизацией

получить разными способами:
методом концевого мечения с помощью полинуклеотидкиназы, осуществляющей присоединение

изотопа фосфора в ﻻ-положении.
методом ник-трансляции с помощью ДНК-полимеразы I
методом случайных праймеров, который основан на применении смеси синтетических олигонуклеотидов (олигомеров), содержащих все возможные комбинации из шести нуклеотидов.
Радиоактивное мечение – один из dNTP содержит в α-положении изотоп фосфора (32 или 33). Радиоактивную метку выявляют с помощью радиоавтографии.
В качестве нерадиоактивной метки часто используют биотин, который присоединяют к одному из четырех dNTP.

двумя способами:
Использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд);
Зонд можно получить

методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена.

двумя способами:
Использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд);
Зонд можно получить

методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена.

его продукт – весь белок или часть – можно обнаружить

иммунологическими методами.

Клетки подвергают лизису, белки фиксируют на фильтре.
3. Наносят на

фильтр первые АТ, которые связываются только с искомым белком.
4. Несвязавшиеся первые АТ удаляют, наносят на фильтр вторые АТ, специфичные в отношении первых, связанные с ферментом (например, щелочной фосфатазой).
5. Отмывают фильтр от несвязавшихся вторых АТ и наносят на фильтр бесцветный субстрат для фермента, при гидролизе которого образуется окрашенный продукт. Гидролиз может произойти только в присутствии вторых антител.
6. Отбирают колонии на чашке, соответствующие окрашенным пятнам на фильтре, и культивируют их. В них может содержаться рекомбинантная ДНК, кодирующая белок, гомологичный первым АТ

Прокариоты не способны удалять интроны из первичных РНК-транскриптов, поэтому правильная

трансляция эукариотических мРНК в бактериальной клетке невозможна.
2. Экспрессия эукариотической ДНК может осуществляться только при наличии прокариотических сигнальных последовательностей, регулирующих транскрипцию и трансляцию.

и эукариот (Б)

или олиго(dT)-сефарозой.
2. Синтез одноцепочечной кДНК на матрице мРНК с помощью

ревертазы, праймера олиго(dT) и четырех dNTP.
3. Синтез двухцепочечной кДНК.
4. После завершения синтеза молекулы мРНК гидролизуют РНК-азой Н, а ДНК обрабатывают нуклеазой SI, в результате чего получаются линейные молекулы ДНК с тупыми концами без шпилек.
5. кДНК встраивают в плазмидный вектор и получают кДНК-библиотеку.
Для скрининга кДНК-библиотеки можно использовать метод гибридизации или иммунологические методы.