Слайд 5Таутомери-зация азотистых оснований – источник ошибок реплика-ции
Слайд 6Енолизация гуанина
Временная енолизация гуанина приводит к формированию GC – AT
транзиции (мутант). Мутация проявляется во втором поколении, если GT не
будет репарирована в первом поколении.
Слайд 12Репарация ДНК
Клетки имеют механизмы исправляющие повреждения ДНК.
Эксцизионная репарация – исправляет
повреждения одной из цепей (пиримидиновые димеры, АР-сайты и т.д.), использует
вторую цепь в качестве матрицы для заполнения пробелов.
Фотореактивация в ответ на возникновение повреждений (пиримидиновых димеров).
Репарация неспаренных нуклеотидов (mismatch repair).
Рекомбинационная репарация (используется неповрежденная цепь).
SOS-репарация. При множественных повреждениях останавливается синтез ДНК.
Слайд 14Эксцизионная репарация оснований
Слайд 16Репарация ДНК
SOS-репарация.
При множественных повреждениях останавливается репликация ДНК. Это вызывает
активацию регулона содержащего до 20 генов, участвующих в процессе репарации.
Синтез
ДНК при SOS-репарации подвержен ошибкам что приводит к повышению частоту мутаций (непрямой мутагенез). Возможно это увеличивает частоту положительных, адаптивных мутаций в популяции бактериальных клеток.
Слайд 17Рост генетического разнообразия
Рекомбинация.
Генетический материал разных молекул ДНК комбинируется в
гибридной молекуле ДНК.
У эукариот – рекомбинация в мейозе. У
прокариот – рекомбинация 3 типов, по молекулярным механизмам схожа с рекомбинацией эукариот.
Горизонтальный перенос генов.
Конъюгация.
Трансформация.
Трансдукция.
Слайд 18Рекомбинация у прокариот
Гомологичная рекомбинация. Реципрокный обмен участками хромосом с аналогичными
нуклеотидными последовательностями. Возможен нереципрокный обмен с короткими участками ДНК.
Сайт-специфическая рекомбинация.
Интеграция многих вирусных геномов. Донор имеет небольшой участок, гомологичный ДНК хозяина.
Транспозиция. С участием мобильных элементов генома.
Слайд 20Нереципрокная гомологичная рекомбинация
Слайд 21Транспозиция
Рекомбинация не зависящая от гомологии участков ДНК.
Происходит во многих сайтах
генома.
Происходит с участием мобильных элементов генома – транспозонов.
Мобильные элементы могут
перемещаться между хромосомной и нехромосомной ДНК.
Мобильные элементы внедряются в геном хозяина, меняя генную структуру или подчиняя экспрессию генов новым регуляторным элементам.
Слайд 22Транспозоны
Транспозоны:
Инсерционные (IS);
Составные (Tn) ;
Репликативные.
Инсерционные и Составные перемещаются путем обычной транспозиции
(вырезать-вставить). Транспозаза катализирует вырезание, участок опознавания составляет 5-9 п.н.
Репликативные
– посредством репликативной транспозиции.
Слайд 23Инсерционные транспозоны (IS)
Открыты в 1970г. П.Сталинжером, Г.Сэдлером и Дж.Шапиро. Обычно
несколько is-элементов содержиться в бактериальной хромоосмею Размеры 750-1550 п.н.
На концах
инвертированные последовательности (IR) необходимые для переноса. В центральной части ген транспозазы, необходимый для распознавания is-элементов и взаимодействия с is-элементами в процессе перемещения.
Слайд 24Составные транспозоны
Содержат дополнительные гены (устойчивости к антибиотикам или токсинам), фланкированные
IS последовательностями.
Частота перемещения зависит от типа транспозона. Считается, что
они произошли от 2 ассоциированных инсерционных транспозона, включая область кодирующих генов между ними.
Слайд 25Репликативный транспозон
Перемещаются посредством механизма репликативной транспозиции. Процесс катализируется белком ресольвазой
(сайт-специфическая рекомбинация).
Исходный транспозон остается в исходном сайте, реплицируясь на
участке ДНК-мишени.
Слайд 28Функции транспозонов
Могут встраиваться в гены, вызывая мутации или стимулируя хромосомные
перестройки, делеции.
Могут переносить стоп-кодоны либо промоторные участки, что влияет
на транскрипцию или трансляцию гена-мишени.
Часто перемещаются между плазмидами, которые могут содержать несколько транспозонов.
Могут перемещаться между плазмидами и хромосомами, создавать плазмиды устойчивости, содержащие несколько генов устойчивости к антибиотикам.
Слайд 29Плазмиды
Плазмиды реплицируются независимо от хромосомы, могут существовать в большом количестве
в клетке. Могут содержать мобильные элементы (транспозоны), способные переходить от
плазмиды к хромосоме и между плазмидами.
1 – бактериальная хромосома, 2 – плазмиды, 3 – деление, 4 – ДНК с включенным материалом плазмид
Слайд 30Плазмиды
Небольшие молекулы ДНК (от 1 000 п.н. до неск. сот
тыс. п.н.), способные к самостоятельной репликации (репликон).
Существуют в свободном состоянии
или в составе хромосом.
Эписомы – плазмиды способные к обратимой интеграции в хромосому.
Крупные плазмиды, содержащие гены «домашнего хозяйства» – называют хромосомами.
Плазмиды состоят из модулей: обязателен репликативен, другие опциональны.
Слайд 31Плазмиды
Плазмиды способны переносить генетический материал при конъюгации бактериальных клеток (F-плазмиды).
В их состав входят гены белков пилей и другие, всего
до 14 генов.
Мобилом – мобильные генетические элементы клетки.
В плазмидах переносятся гены деградации ксенобиотиков и азотфиксирующих ферментов.
Слайд 34Горизонтальный (латеральный) перенос генов
Конъюгация.
Прямой перенос ДНК во время временного
физического контакта клеток.
Трансформация.
Перенос свободных молекул ДНК.
Трансдукция.
Перенос молекул ДНК с
участием бактериальных вирусов.
Слайд 35Горизонтальный (латеральный) перенос генов
Перенос генов между 2 прокариотическими организмами. Важный
механизм увеличения генетического разнообразия у прокариот.
Часть геном – экзогенот
переноситься от донора к реципиенту и интегрируется в эндогенот. Мерозигот временное диплоидное состояние части наследственного материала прокариот.
Бактерии способны обмениваться участками наследственного материала, в том числе генами устойчивости к антибиотикам. Обмен может происходить между непатогенными и патогенными формами.
Слайд 37Конъюгация бактерий
Конъюгация – перенос генетического материала между бактериальными клетками при
помощи прямого клеточного контакта.
Включает F-фактор (F-плазмиду), половые пили и
систему секреции IV типа.
При F+ X F- конъюгации, F-плазмида существует независимо от бактериальной хромосомы и переноситься в клетку реципиента целиком, гены донора обычно не переносятся.
При Hfr-конъюгации, происходит частичная репликация донорской ДНК, переноситься только цепь ДНК (Hfr), содержащая гены плазмиды и хозяина, F-плазмида интегрирована в хромосому хозяина и не переноситься целиком.
Слайд 38Эксперимент Д. Ледерберга и Э. Тэйтума (1946), доказавший явление конъюгации
Слайд 39Эксперимент Б. Дэвиса, показавший роль физического контакта при конъюгации
Слайд 41F+ X F- конъюгация
F+ X F- конъюгация
Слайд 43Инсерция F-плазмиды в бактериальную хромосому с образованием Hfr-клетки
Слайд 44Конъюгация Hfr-клетки с новым реципиентом
Слайд 45Трансформация
Впервые явление трансформации описано Ф. Гриффитом в 1928.
Перенос ДНК
без участия дополнительных структур. Внесенная ДНК включается в геном и
может наследоваться.
Часто фрагменты ДНК выходят во внешнюю среду при лизисе клетки, при попадании в «компетентную» клетку вызывают трансформацию. Средняя частота трансформации «компетентных клеток» 10-3.
Компетентность зависит от размеров популяции, при достижении больших размеров 107-108 кл./мл., на поверхности экспрессируется белок отвечающий за трансформацию. Происходит в почвенных и водных экосистемах.
Слайд 46Трансформация
фрагментами ДНК и плазмидами
Слайд 47Трансформация на примере S.pneumoniae
Слайд 50Перенос ДНК в клетку
Для переноса ДНК через клеточные оболочки имеются
сложные системы, включающие ферменты нуклеазы, транслоказы и другие, а также
некоторые структурные белки образующие канал для перемещения ДНК.
Слайд 51Трансдукция
Трансдукцию осуществляют бактериофаги, переносящие невирусную информацию. Фаги – вирусы бактерий,
используют аппарат синтеза белка и репликации ДНК клетки.
Ошибки в жизненном
цикле фага могут приводить к попаданию в капсид вируса фрагментов ДНК бактерии.
Вирулентные фаги вызывают лизис клетки после увеличения количества фаговых частиц в клетке – литический цикл.
Умеренные фаги внедряются в геном хозяина, совместно реплицируются длительное время – лизогенный цикл.
Профаг – внедренный в хромосому геном вируса.
Слайд 53Общая трансдукция
Описана в 1951г. Дж.Ледербергом и Н.Циндером.
Неспецифический перенос разнообразных генов
хозяина.
Во время лизиса клетки-хозяина обломки ДНК хозяина (0,5 –
2,5 %) укладываются под капсидную оболочку вместе с ДНК фага.
Характерна для литических циклов. Наследование внесенной ДНК происходит только при условии успешной гомологичной рекомбинации с ДНК клетки-хозяина.
Если ген не может быть интегрирован в геном хозяина – абортивная трансдукция.
Слайд 57Специфическая трансдукция
Перенос ограниченного числа генов, расположенных в участке включения ДНК
фага в хромосому бактерии.
Происходит в результате ошибки лизогенного цикла, когда
профаг покидает хромосому хозяина, вырезание может быть неточным, захватывая участок ДНК хозяина (5-10%).
Наиболее известный пример – фаг лямбда, который размножается 2 способами: при литическом цикле присутствует в виде автономной молекулы ДНК, которая обеспечивает синтез фаговых частиц. При лизогенном цикле ДНК фага интегрирована в хромосому и реплицируется пассивно.
Дефектный фаг может содержать гены, следующие на хромосоме за точкой внедрения и профагом.
Слайд 61Опыт Джона Кернса (1988 г.)
В работе использовался мутантный штамм
lac- бактерий, неспособных к метаболизму лактозы, такие бактерии не растут
на средах, содержащих лактозу в качестве единственного источника энергии. При пересеве таких бактерий на среду с лактозой вырастают только бактерии -ревертанты lac+.
После пересева и суточного роста наблюдалась картина, аналогичная опыту Лурии и Дельбрюка, однако через 2 и 3 суток роста количество устойчивых колоний значительно возросло.
Слайд 62CRISP-кассеты
В 2005 году сотрудниками Danisco Рудольфом Барангу и Филиппом Хорватом
проводились опыты с культурами Streptococcus thermophilus. Эти работы имели практическую
цель получить штаммы бактерии, применяемой для производства молочных продуктов, устойчивой к бактериофагам.
В результате были открыты CRISP-кассеты – участки ДНК, одержащие короткие фрагменты (спейсеры), схожие у бактерии и фага. Считается, что набор спейсеров отвечает за способность фага поражать бактерию.