Лекция № 8 Титин (тайтин/коннектин) - гигантский эластичный белок саркомерного

формирующий третий тип нитей
Курс лекций по дисциплине
«Структурные и функциональные

особенности
поперечно-полосатых и гладких мышц»

Институт теоретической и экспериментальной
биофизики РАН
(ИТЭБ РАН)

или классы актинов синтезируются в немышечных или мышечных клетках?
3. Что

такое G-актин (Г-актин) и F-актин (Ф-актин)?

4. Что такое тредмиллинг?

5. Назовите не менее трёх актинсвязывающихся белков.

6. Сколько нитей F-актина в тонкой нити в саркомере поперечнополосатой мышцы?

7. В какой части саркомера расположена молекула альфа-актинина?

медленно гидролизуется до АДФ – проявляет свойства АТФ-азы. Полимеризация сопровождается

гидролизом АТФ, что не необходимо т.к. полимеризация идет и в присутствии негидролизуемых аналогов АТФ Полимеризация состоит из нескольких процессов: нуклеация, элонгация, диссоциация, фрагментация, стыковка. Эти процессы протекают одновременно. Нуклеация – соединение трех G-актинов – инициация полимеризации. Элонгация - наращивание цепи актина путем присоединения G-актина к (+)-концу F-актина. Диссоциация - укорачивание цепи. Деполимеризация актина имеет одинаковую скорость с обоих концов Фрагментация - в результате теплового движения F-актин может фрагментироваться. Стыковка - отдельные фрагменты могут соединяться друг с другом конец в конец. При конценрации G>F – одновременно происходит полимеризация (+) и (–) конца. Если G

Тонкие нити (актиновые) (повторение)
Актин открыл Ф.Б. Штрауб в 1942 году. Белок получил название за способность активировать гидролиз АТФ.

Тредмиллинг – перемещение («путешествие»)  актиновых мономеров по нити.

ситуацию на планете
Более 11 тыс. исследователей из 153 стран подписали

научную статью «Предупреждение учёных мира о климатическом кризисе», в которой говорится о чрезвычайной ситуации на планете. Документ содержит анализ основных причин изменения климата и программу спасения Земли от глобального потепления, состоящую из шести основных пунктов. Статья опубликована в журнале BioScience.

Вулф из Орегонского университета. Они отметили, что с момента проведения

в Женеве Первой всемирной конференции по климату прошло уже 40 лет. И за это время неоднократно указывалось на растущую угрозу глобального потепления и звучали призывы к правительствам всех стран принять незамедлительные меры, чтобы остановить этот прсс.

А воз и ныне там!

лесов увеличилась на 50%, выбросы углекислого газа — на 18%,

производство мяса на душу населения — на 11%. Также экологи отметили, что каждое десятилетие число глобальных стихийных бедствий и аномальных природных явлений росло на 44%, а толщина полярного льда уменьшалась в среднем на 4,84 м.

Учёные подчеркнули необходимость глобального пересмотра взаимоотношений человека и природы — парниковый эффект может привести к цепной реакции и разрушению экосистем на суше и в Мировом океане.

необходимо сконцентрировать все силы. В своеобразную программу спасения планеты вошли:

реформа энергетического сектора и переход к возобновляемым источникам энергии,
сокращение воздействия на атмосферу загрязняющих веществ,
восстановление экосистем,
охрана экосистем,
реформа продовольственной политики (снижение потребления мяса и изменение рациона в пользу потребления пищи растительного происхождения),
а также построение безуглеродной экономики и стабилизация численности населения Земли.

и С-белка. Половина молекул миозина обращена головками к одному концу

нити, а вторая половина - к другому. Гигантский белок тайтин (титин) связывает свободные концы толстых нитей с Z-линией.

Нити миозина (in vitro)

Нити миозина при большем увеличении

Схематическое изображение
толстой нити (Harrington, 1971)

Толстые нити имеют диаметр 15 нм

Головка размером 16,5х6,5х4 нм.

Строение миозина (Повторение)

мышц присутствуют два типа белковых нитей:

Миозиновые (толстые) и
Актиновые

(тонкие).

Однако, практически сразу же после открытия саркомерной структуры мышц и появления гипотезы скользящих нитей, стали появляться научные данные, свидетельствующие о том, что в саркомере может быть третий тип нитей.

and Hodge
(1950). The top figure was
negatively stained with
phosphomolybdic acid. The
lower

fibril was imaged by a
platinum shadow technique

Из An historical perspective of the discovery of titin filaments
Cris dos Remedios & Darcy Gilmour

Первые ЭМ исследования ультраструктуры мышц

типа нитей в саркомере (близ Z-диска)

промежутках между концами толстых и тонких нитей при больших степенях

растяжения саркомеров (Sjostrand, 1962);
«остаточные» – нити, остающиеся после удаления миозина и актина из саркомеров (Guba et al., 1968; Remedios, 1978);
«сверхтонкие» – нити, имеющие малый диаметр (~3-5 нм) (Huxley & Peachy, 1961; McNeill & Hoyle, 1967; Hoyle et al., 1968);
«концевые филаменты» – тонкие нити, диаметром 4-5 нм, видимые на концах изолированных толстых нитей (Trinick, 1981, 1984);
«G-нити» и «коннектиновые» нити – соединяющие концы толстых нитей с Z-диском (Auber & Couteaux, 1963; Trombitas & Tigyi-Sebes, 1974; Locker & Leet, 1976).

et al., 1977; Sawada et al., 1983)
Увеличение 53000
Увеличение 68000
Коннектин

был изолирован из скелетных мышц крысы, кролика, курицы, лягушки, сердечной мышцы коровы, из гладких мышц курицы и поперечно-полосатых мышц рака.

et al., 1979
Maruyama
et al., 1981
Т1 - 1400

кДа
Т2 - 1200 кДа

α - 2800 кДа
β - 2100 кДа
(Maruyama et al, 1984)

m. psoas кролика

грудная мышца цыплёнка

на сегодняшний день белков
-Первооткрыватели:
K. Maruyama и K. Wang

-Длина молекулы

более 1 мкм
-Содержит 300 глобулярных доменов
- М.в. около 4 МДа,
-Ген титина содержит 363 экзона, которые кодируют 38138 аминокислотных остатков.

-Титаник - крупнейший в мире пассажирский пароход на момент своей постройки
Создатели:
Томас Эндрюс и Джозев Брюс Исмей

Длина около 300 м,
ширина 30 м
водоизмещение 52310 тонн
-На Титанике были установлены паровые машины суммарной мощностью 38390 л.с.

A, Layout of titin-isoforms in the cardiac halfsarcomere, showing stiff

N2B coexpressed with compliant N2BA. B, Domain structure of the canonical titin sequence (UniProtKB identifier Q8WZ42-1), main splicing pathways (green lines), and binding sites of known titin ligands. CMYA5, cardiomyopathyassociated protein-5; Ex, exon in genomic human titin sequence; FHL1 and 2, four-and-a-half-LIM-domain protein-1 and -2; FNIII, fibronectin type III–like domain; HSP27, heat shock protein-27; HSP90, heat shock protein-90; Ig, immunoglobulin-like domain; MARPs, muscle ankyrin repeat proteins; MURF1/2, muscle-specific RING-finger protein-1/-2; MyBP-C, myosin-binding protein-C; Nbr1, neighbor of BRCA1 gene-1; P, titin phosphosite (kinase known); PEVK, titin region rich in proline, glutamate, valine, and lysine; sANK-1, smallankyrin-1 isoform; Smyd2, SET and MYND domain–containing protein-2; and TK, titin kinase domain.

Proteomic databases list hundreds of potential phosphosites in titin searchable by web-based resources, for example, http://
gygi.med.harvard.edu/phosphomouse/index.php or http:// cpr1.sund.ku.dk/cgi-bin/PTM.pl.

Linke, Hamdani, Circ Res. 2014

Somerville LL, Wang K.
mere matrix of striated muscle: in vivo phosphorylation of titin and nebulin in mouse diaphragm muscle
Arch Biochem Biophys. 1988 Apr;262(1):118-29.

Известно, что и титин,
и небулин фосфорилируются
in vivo.

!

Титин – полифункциональный белок, взаимодействующий со многими белками в саркомере.

время миофибриллогенеза;
регулирует длину миозинсодержащих нитей и отвечает за

расположение их в центре саркомера;
вносит вклад в пассивное напряжение, развиваемое мышцей при растяжении;
участвует в регуляции мышечного сокращения.

Кроме этого результаты недавно проведенных исследований позволяют сделать предположение, что титин может выполнять в саркомере роль сенсора натяжения (механосенсора, strech sensor), участвуя тем самым в регуляции процессов внутриклеточной сигнализации, индуцируемых натяжением.

Функции титина

участвующим в дифференцировке миоцитов (Knoll et al., 2002), предполагается участие

Z-области титина в регуляции экспрессии белков.

Растяжение
кардиомиоцита

Экспрессия натрийуретического пептида мозга (BNP) и предсердного натрийуретического фактора (ANF)

Кроме этого, показано, что нарушения в белковом комплексе LIM/телетонин/Z-домены титина, вызванные нокаутом гена, кодирующего LIM-белок, приводили к развитию дилатационной кардиомиопатии у мышей (Hoshijima, 2006).

ток калия в клетке (Furukawa et al., 2001).
Обнаружено связывание телетонина

с миостатином (мышечным ростовым фактором) и кальсарцином-3 (calsarcin-3), участвующим в регуляции мышечного роста. Полагают, что телетонин может регулировать секрецию миостатина (Nicholas et al., 2002 ). Функциональная роль титина в этих взаимодействиях неясна.

Область титиновой молекулы в Z-диске саркомера имеет фосфорилируемые участки (Gregorio et al., 1999). Предполагается, что их фосфорилирование может иметь значение для сборки Z-диска во время миогенеза.

Исследуются блокаторы действия миостатина через
миостатиновые рецепторы.
Функциональная роль

титина в секреции и действии миостатина неясна.

«Антимиостатиновый» бык

элементы I-области титина
иммуноглобулин-подобные домены (Ig C2)
-уникальные последовательности

N2A

N2B

PEVK

Функции I-области титина:
-Развитие «пассивной» силы при растяжении саркомера сверх длины покоя,
Развитие «возвратной» силы при сжатии саркомера короче длины покоя,
Пассивная и возвратная сила титина регулируют перекрытие толстых и тонких нитей в саркомере, а также центрируют толстые нити в центре саркомера (Horowits et al., 1986).

вносит вклад в пассивное напряжение, развиваемое мышцей при растяжении и

развивает возвратную силу при сокращении саркомера

Схема саркомера

с миозиновыми нитями, взаимодействовал и с нитями актина.
Упруго-эластичные свойства I-области

титина могут быть задействованы и в регуляции актин-миозинового взаимодействия при растяжении саркомера.

Полагают, что развитие пассивного натяжения I-областью тайтина при растяжении саркомера может модулировать актин-миозиновое взаимодействие, уменьшая расстояние между тонкими и толстыми нитями.

(Cazorla et al., 2000)

мышечных белков с анкириновыми повторами (CARP, ankrd-2, DARP);
с комплексом MAP-киназ

(mytogen-activated protein kinase)

Регуляция экспрессии
мышечных генов,
(Hoshijima, 2006)

Фосфорилирование N2В/PEVK -последовательностей титина сердечной мышцы

Снижение/увеличение пассивного натяжения, развиваемого I-областью титина при растяжении саркомера
(Krüger et al., 2006).

нерастяжима и, предположительно, выполняет несколько важных функций:

-служит остовом для сборки

толстых нитей во время миофибриллогенеза (Houmeida et al., 1995, Person et al., 2000);

Участвует в стабилизации структуры М-линии и всего саркомера (Agarkova et al., 2004);

Участвует в регуляции мышечного сокращения, изменяя ферментативные свойства миозина и его Са2+-чувствительность
(Muhle-Goll et al., 2001; Podlubnaya et al., 2003; Вихлянцев, Подлубная 2003).

белков
Механическая
нагрузка
Активация
киназы титина
Фосфори-
лирование
Nbr1 и p62
Активация белкового синтеза
Взаимодействие

Nbr1 и p62 c
MURF 2

Ингибирование белкового синтеза

Инактивация
мышцы
(например,
6 ч после
денервации )

Дефосфори-
лирование
Nbr1 и р62

Транслокация
MURF 2 в ядро

Ингибирование SRF-зависимой экспрессии мышечных генов и запуск убиквитин-зависимой деградации белков, приводящей к развитию мышечной атрофии

(Lange et al., 2005)

микрофотографии одиночных выпрямленных молекул титина скелетных мышц кролика (А) и

активного суслика (Б) в растворе 0.5 M KCl, 10 мМ имидазол, 50 % глицерин, рН 7.0, полученных методом кругового оттенения платиной.
Шкала 200 нм.

Вихлянцев, 2005

мМ имидазол, рН 7.0. Шкала 200 нм
Вихлянцев, 2005

титина
Вихлянцев, 2005

в растворе 50 мМ MgCl2, 5 мМ имидазол-HCL, рН 7.0.

Шкала 100 нм.

Вихлянцев, 2005

Наши исследования взаимодействия титина с актином