Слайд 1Молекулярно-цитогенетическая диагностика острых лейкозов
Слайд 2Хромосомные нарушения
ключевая роль в патогенезе опухолей
критерии для классификации гематологических опухолей
цитогенетические
маркеры опухолей
цитогенетические факторы прогноза
стратификация больных к терапии
«прицельня терапия» -
коррекция имеющихся нарушений на генетическом или биохимическом уровне
оценка эффективности терапии и контроль минимальной резидуальной болезни
Слайд 3Материал для исследования
Клетки:
костного мозга
крови
лимфоузла
селезенки
любой опухолевой ткани
Слайд 4An International System for Human Cytogenetic Nomenclature
Денверская классификация хромосом,
1960 г. - первая Международная система цитогенетической номенклатуры хромосом человека, обеспечившая
международную стандартизацию исследований хромосом еще на начальных этапах становления цитогенетики человека.
7 групп
на основании размеров хромосом и положения центромеры
Слайд 5дифференциальная окраска хромосом
(chromosome banding)
позволяет выявлять закономерно расположенные и закрепленные
наследственно участки плотной конденсации вещества хромосом и, на основе их
расположения, идентифицировать хромосомы, не различающиеся по признакам, видимым без такой окраски.
1968 г. - Torbjörn Caspersson
Q-окраска (Quinacrine – акрихин)
Слайд 6
1971 г. - Marina Seabright
G-окраска (Giemsa – Гимза)
Парижская классификация
хромосом, 1971
Слайд 7Хромосомы человека
Метафаза
Кариотип: 46,XY
Слайд 9Стандартное цитогенетическое
исследование и FISH
44,XX,der(1)t(1;3)(q31;q10),der(8)t(3;8)(q10;q21),
t(11;14)(q13;q32),add(12)(p13),-13,add(16)(p13),-17
суспензия опухолевых клеток
отпечаток опухоли
парафиновый блок
мазок костного
мозга
Слайд 12Стандартное цитогенетическое исследование
культивирование клеток
17-24 ч
прямая проба
задержка митоза (колхицин/колцемид)
обработка гипотоническим
раствором KCl
фиксация (метанол+ледяная уксусная кислота)
приготовление препаратов и окраска хромосом
кариотипирование
Слайд 13Количественные изменения кариотипа
трисомия
дополнительная хромосома
в двух и более метафазах –
гипердиплоидия
моносомия
отсутствие хромосомы
в трех и более метафазах –
гиподиплоидия
Слайд 14реципрокная транслокация -
обмен участками хромосом
Структурные хромосомные аберрации
9
22
t(9;22)(q34;q11)
Слайд 15Инверсии
парацентрическая инверсия
поворот участка хромосомы
на 1800 вокруг центромеры
перицентрическая инверсия
поворот
участка хромосомы
на 1800 внутри плеча
3 inv(3)(q21q26)
16
inv(16)(p13q22)
Инсерция
перемещение
хромосомного сегмента в новое
положение внутри той же или другой хромосомы
1 8 ins(1;8)(q21;q22q24)
Слайд 17 Делеция
потеря участка
хромосомы
5 del(5)(q13q33)
Слайд 22Дополнительный хромосомный материал
неизвестного происхождения
add
Слайд 2373~77XX,t(Y;13)(q10;q10)x2,t(1;5)(p22;q14~15),-2x2,add(2)(q37)or t(1;2)(q31;q37),-3,-4,
add(4)(p16)x2,+add(5) (p22;q14~15)or t(1;5)(p22;q14~15),add(6)(p23~25),add(7)(q36),-9,-10x2,
del(11)(p12),-12,add(12)(?q23),del(13)(q22),-14,add(14)(q32),-15,-17x2,add(20)(p13),-21,add(22)(p11),
+add(22)(p11)or t(9;22)(q10;q10),+3 mar
Дериват хромосомы
der
Слайд 2445,XX,add(2)(p21),-3,der(3)inv(3)(q21q26),-5,del(5)(q13q33),del(6)(q13),-7,-8,
del(12)(p12),der(12)del(12)(q22),+5mar[4]/ 45,XX,add(2)(p21) ,del(3)( q26),der(4),
-5,del(6)(q13),-7,-8,-11,der(11),del(12)(p12),der(12)del(12)(q22),-15,-18,+5mar[6]
Маркерная хромосома
mar
Слайд 25Комплексные (множественные) перестройки
три и более аберрации
Слайд 26Кариотип: 46,XY [20]
Кариотип: 46,XX,t(15;17)(q22;q21) [20]
Кариотип: 47,XY,t(9;22)(q34;q11),+8 [16]/46,XY [4]
Кариотип: 46,XX,t(9;22)(q34;q11) [6]/47,idem,+8
[14]
Кариотип: 46,XX,t(9;22)(q34;q11) [12]/46,XX,del(13)(q14) [15]
Кариотип: 43-47,XX,add(2)(p21),inv(3)(q21q26),der(4),-5,del(6)(q13),-7,-8,der(11),
del(12)(p?12),-15,-18,+5mar [cp10]
An International System for Human
Cytogenetic Nomenclature, 2013
Слайд 27Fluorescence in situ hybridization (FISH)
окраска флюорохромами участков комплементарной ДНК
прицельный поиск
определенных хромосомных нарушений
интерфазная и метафазная
Слайд 28Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH)
Слайд 29 Центромерные пробы
Моносомия
Трисомия
Слайд 30t(14;18)(q32;q21)
t(18q21)/BCL2
Пробы для выявления транслокаций
Dual Fusion Translocation Probe
Break Apart Probe
Слайд 31Пробы для выявления инверсий/транслокаций
Слайд 33Пробы для выявления делеций и моносомий
делеция 17р13/р53
моносомия 17
Слайд 35Мulticolor FISH (M-FISH)
www.metasystems-international.com
флюорохромы:
FITC
Spectrum Orange ™
TexasRed
®
DEAC
Cy5 ®
Слайд 36раздельная цифровая регистрация сигнала всех используемых флюорохромов при последовательной смене
набора фильтров
специальное ПО переводит информацию об уровне сигналов флюорохромов в
каждой точке изображения в псевдоцвета
не позволяет выявлять внутрихромосомные аномалии и перестройки между гомологичными хромосомами
Слайд 37Multicolor BAND (M-BAND)
www.metasystems-international.com
многоцветная идентификация хромосом
высокого разрешения
район специфичные ДНК пробы
помечены различными флюорохромами или их комбинациями
ПО проводит сравнительный анализ уровня
свечения различных флюорохромов
Слайд 38An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, 2013
nuc ish:
(D7Z1,D7S522)x2 [200]
nuc ish: (D7Z1x2,D7S522x1) [62/200]
nuc ish: (ABL,BCR)x2 [200]
nuc ish: (ABL,BCR)x3(ABL
con BCRx2) [198/200]
nuc ish: (MYCx2)[200]
nuc ish: (MYCx2) (5’MYC sep 3’MYCx1)[180/200]
Слайд 39Филадельфийская хромосома
(1960 г., Peter C. Nowell and
David A.
Hungerford)
сплошная окраска хромосом
Хронический миелолейкоз - первое гематологическое заболевание, при котором
был обнаружен хромосомный маркер и цитогенетическая клональность
Слайд 40(1973 г., Janet Rowley)
______________________________
9
22
t(9;22)(q34;q11)
Lore Zech
Слайд 41Миелодиспластический синдром
Хромосомные аберрации - ~50% случаев
Слайд 42WHO Classification of Tumours
of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, 2008
Слайд 43del(5)(q13q33)
10%
5q- синдром:
рефрактерная макроцитарная анемия;
лейкоциты - N или умеренно ;
тромбоциты
- N или ;
гипоплазия и дисплазия эритроидного (часто мегалобластоидный
характер кроветворения) и мегакариоцитарного ростков
болеют преимущественно женщины (65-70 лет)
del(5q) единственная в кариотипе
благоприятный прогноз
терапия – леналидомид
Слайд 447
del(7)(q22)
10%
чаще в составе комплексного кариотипа
характерна для вторичного МДС
риск трансформации в
ОМЛ
Слайд 453
inv(3)(q21q26)
или t(3;3)(q21;q26)
2%
EVI1/3q26
N или уровень Тр
гиперклеточный к/м
выраженная трехростковая
дисплазия,
особенно мегакариоциоцитарного
ростка
высокий риск трансформации в ОМЛ
Слайд 46трисомия 8
10%
20
del(20)(q11)
единственное нарушение в кариотипе –
дисплазия эритроидного и
мегакариоцитарного
ростков
потеря хромосомы Y
5%
5-8%
может быть возрастная
Слайд 47Прогностические группы
(IPSS prognostic index, 1997; WHO, 2008)
Слайд 49Острые миелоидные лейкозы
WHO Classification of Tumours
of Haematopoietic and Lymphoid
Tissues, 2008
Хромосомные нарушения –
80-90% случаев ОМЛ
Слайд 50t(15;17)(q22;q21)
Острый промиелоцитарный лейкоз
t(15;17)(q22;q21)
5-8% ОМЛ
химерный ген PML-RARα
прицельная терапия – (АТРА) +
ХТ
Слайд 51вариантные:
t(11;17)(q23;q21) - ZBTB16;
t(11;17)(q13;q21) - NUMA1;
t(5;17)(q32;q21) - NPM1;
t(17;17)(q11;q21) - STATSB
Слайд 525% ОМЛ
10% M2 FAB
химерный ген RUNX1-RUNX1T1
t(8;21)(q22;q22)
t(8;21)(q22;q22)
Слайд 53inv(16)(p13q22)
16
5-8% ОМЛ
чаще у молодых больных
M4эо FAB
химерный ген CBFB-MYH11
в 40% случаев
- вторичные
хромосомные аберрации: +22, +8 (10 -15% каждая),
del(7q)
и +21 (5%)
inv(16)(p13q22) или t(16;16)(p13;q22)
Слайд 54t(15;17)(q22;q21)
t(8;21)(q22;q22)
inv(16)(p13q22) или t(16;16)(p13;q22)
Высокоспецифичны для ОМЛ
Диагноз ОМЛ вне зависимости от количества
БК
Слайд 559
11
t(9;11)(p22;q23)
2% ОМЛ взрослых
9-12% - дети
M5 FAB
химерный ген MLLT3(AF9)-MLL
t(v;11q23)/MLL
>80 хромосомных
партнеров
ABBOTT
t(v;11q23)/MLL
Слайд 56вариантные транслокации:
t(4;11)(q21;q23) - MLLT2(AF4)
t(11;19)(q23;p13.3) - MLLT1(ENL)
t(10;11)(p12q23) - MLLT1O
(AF1O)
t(6;11)(q27;q23) - MLLT4 (AF6)
t(11;19)(q23;p13.1) - ELL
Слайд 576
9
t(6;9)(p23;q34)
химерный ген DEK-NUP214
1-2% ОМЛ взрослых и детей
базофилия в к/м и
п/к – 50% случаев
трехростковая дисплазия
t(6;9)(p23;q34)
Слайд 58inv(3)(q21q26) или t(3;3)(q21;q26)
inv(3)(q21q26)
RPN/EVI1
de novo или из МДС
N или
уровень Тр
гиперклеточный к/м
выраженная трехростковая дисплазия,
особенно мегакариоциоцитарного
ростка (атипичные мегакариоциты)
Слайд 59t(1;22)(p13;q13)
RBM15-MKL1
de novo
мегакариобластный лейкоз (М7)
дети до 3х лет
органомегалия
Слайд 60другие
del5q/-5
del7q/-7
+8
del9p21
del11q23
del13q
del17p
-Y
t(9;22)(q34;q11)
Слайд 61Цитогенетические группы прогноза ОМЛ
Слайд 62Молекулярно-генетические маркеры прогноза ОМЛ
FLT3/13q12.2
внутренние тандемные дупликации (ITD)
точечные мутации
в тирозинкиназном домене (TKD) ?
NPM1/5q35
de novo М4 или М5 ОМЛ
у
пожилых больных с нормальным кариотипом
СЕВРА/ 19q13.1
de novo М1 или М2 ОМЛ, редко М4 или М5
Слайд 63Метод основан на разделении меченных флюоресцентным
красителем ПЦР-продуктов в капиллярах, заполненных
гелем.
ПЦР с праймерами, меченными флюоресцентной меткой.
При капиллярном
электрофорезе денатурированные
ПЦР-продукты разделяются по длине с точностью до одного
нуклеотида, вне зависимости от нуклеотидного состава.
Для исследования используется автоматический анализатор
нуклеиновых кислот.
Метод фрагментного анализа
(Лаборатория молекулярной гематологии,
зав. лаб. д.б.н. Судариков А.Б.)
Слайд 64Döhner H, et al. Blood. 2010 Jan 21;115(3):453-74.
Цитогенетические и молекулярно-генетические
факторы прогноза ОМЛ
Слайд 66Острые В-лимфобластные лейкозы
WHO Classification of Tumours
of Haematopoietic and Lymphoid
Tissues, 2008
Слайд 67Стандартное цитогенетическое исследование + дополнительные перестройки
взрослые – 25%
дети – 3-5%
химерный
ген BCR/ABL
t(9;22)(q34;q11)
Слайд 685-15%
самая частая t(4;11)(q21;q23)
химерный ген AF4-MLL
t(v;11q23)/MLL
>80 хромосомных партнеров
для 35 – гены-партнеры
не охарактеризованы
на молекулярном уровне
Слайд 69дети – 25%
взрослые – очень редко
химерный ген ETV6-RUNX1
не выявляется при
стандартном
цитогенетическом исследовании
t(12;21)(р12;q22)
ABBOTT
Слайд 70t(1;19)(q23;p13)
дети – 6%
взрослые – очень редко
химерный ген TCF3-PBX1
сбалансированная форма
несбалансированная форма
Слайд 71iAMP21
Le Coniat et al., 2001
Vysis LSI ETV6/RUNX1 ES DC
Слайд 72Количественные изменения кариотипа
Гипердиплоидия
50-67 хромосом (большая гипердиплоидия)
дети - 20-30%
взрослые –
редко
Гиподиплоидия
Слайд 73Прогноз
Обязательно выполнение FISH для выявления
t(9;22)(q34;q11)
t(11q23)/MLL
Слайд 74Острые Т-лимфобластные лейкозы
Хромосомные нарушения – 50-70% случаев
транслокации TCR a/d -
14q11, TCR β – 7q35 и TCR γ - 7p14-
15
с многочисленными хромосомными партнерами:
HOX 11( TLX1) - 10q24 - 30% случаев
HOX11L2 (TLX3) - 5q35 - 10-15%
С-MYC – 8q24
TAL1 - 1p32
RBTN1 - 11p15
RBTN2 - 11p13
LYL1 - 19p1 3
и др.
Слайд 75
Контроль минимальной резидуальной болезни
по выявленному до лечения цитогенетическому
маркеру
(острые лейкозы)
Исследование химеризма после разнополой
трансплантации ПСКК
XX/XY
Слайд 7642-44,XY,del(2)(p21), -5,-7,del(12)(p12),-12,-13,-15,-16,-17,-19, 42-44,XY, t(5;15;17;22),del
13,del 15, t(7;13), t(16;17;19;21)
+6-7mar [cp30]
Слайд 7746,XY,add(20)(p?12) [7]/46,XY[13]
46,XY,der(11)t(X;11)(?pq;q)t(11;20p;?pq),der(11)t(11;20)(p;?)ins(17;11)
![45,XX,add(2)(p21),-3,der(3)inv(3)(q21q26),-5,del(5)(q13q33),del(6)(q13),-7,-8,del(12)(p12),der(12)del(12)(q22),+5mar[4]/ 45,XX,add(2)(p21) ,del(3)( q26),der(4),-5,del(6)(q13),-7,-8,-11,der(11),del(12)(p12),der(12)del(12)(q22),-15,-18,+5mar[6]Маркерная хромосома mar](/img/thumbs/abab7b7f451b1acf500f020eddd65054-800x.jpg "Молекулярно-цитогенетическая диагностика острых лейкозов 45,XX,add(2)(p21),-3,der(3)inv(3)(q21q26),-5,del(5)(q13q33),del(6)(q13),-7,-8,del(12)(p12),der(12)del(12)(q22),+5mar[4]/ 45,XX,add(2)(p21) ,del(3)( q26),der(4),-5,del(6)(q13),-7,-8,-11,der(11),del(12)(p12),der(12)del(12)(q22),-15,-18,+5mar[6]Маркерная хромосома mar")
![Кариотип: 46,XY [20]Кариотип: 46,XX,t(15;17)(q22;q21) [20]Кариотип: 47,XY,t(9;22)(q34;q11),+8 [16]/46,XY [4]Кариотип: 46,XX,t(9;22)(q34;q11) [6]/47,idem,+8 [14]Кариотип: 46,XX,t(9;22)(q34;q11) [12]/46,XX,del(13)(q14) [15]Кариотип: 43-47,XX,add(2)(p21),inv(3)(q21q26),der(4),-5,del(6)(q13),-7,-8,der(11),del(12)(p?12),-15,-18,+5mar [cp10]An International](/img/thumbs/34d2133bb9f61ba80f2bacdf7c385edb-800x.jpg "Молекулярно-цитогенетическая диагностика острых лейкозов Кариотип: 46,XY [20]Кариотип: 46,XX,t(15;17)(q22;q21) [20]Кариотип: 47,XY,t(9;22)(q34;q11),+8 [16]/46,XY [4]Кариотип: 46,XX,t(9;22)(q34;q11) [6]/47,idem,+8 [14]Кариотип:")
![An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, 2013 nuc ish: (D7Z1,D7S522)x2 [200]nuc ish: (D7Z1x2,D7S522x1) [62/200]nuc ish: (ABL,BCR)x2](/img/thumbs/fc1bee2d1b2c6a46aa4c41f1182209d6-800x.jpg "Молекулярно-цитогенетическая диагностика острых лейкозов An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, 2013 nuc ish: (D7Z1,D7S522)x2")
![42-44,XY,del(2)(p21), -5,-7,del(12)(p12),-12,-13,-15,-16,-17,-19, 42-44,XY, t(5;15;17;22),del 13,del 15, t(7;13), t(16;17;19;21)+6-7mar [cp30]](/img/thumbs/4dbf443fd68bb74121b4ebf6ed3e930c-800x.jpg "Молекулярно-цитогенетическая диагностика острых лейкозов 42-44,XY,del(2)(p21), -5,-7,del(12)(p12),-12,-13,-15,-16,-17,-19, 42-44,XY, t(5;15;17;22),del 13,del 15, t(7;13), t(16;17;19;21)+6-7mar [cp30]")
![46,XY,add(20)(p?12) [7]/46,XY[13]](/img/thumbs/d656f724a6d5b4d183e8507789bc88e1-800x.jpg "Молекулярно-цитогенетическая диагностика острых лейкозов 46,XY,add(20)(p?12) [7]/46,XY[13] 46,XY,der(11)t(X;11)(?pq;q)t(11;20p;?pq),der(11)t(11;20)(p;?)ins(17;11)")
