Слайд 2Физиология прокариот
Лекция № 6
Слайд 3Жизненные функции микроорганизмов: питание, дыхание, рост и размножение — изучает
физиология. В основе физиологических функций лежит непрерывный обмен веществ (метаболизм).
Сущность обмена веществ составляют два противоположных, но взаимосвязанных процесса: ассимиляция (анаболизм) и диссимиляция (катаболизм).
Слайд 5Физиоло́гия (от греческого φύσις — природа и λόγος — знание) — наука о
сущности живого, жизни в норме и при патологиях, то есть
о закономерностях функционирования и регуляции биологических систем разного уровня организации
Слайд 6Питание клеток микроорганизмов – включение в метаболические реакции любого характера
тех или иных соединений внешней среды. Питательным веществом следует считать
любое химическое вещество, которое способно удовлетворять энергетические потребности клетки либо анаболические функции, либо те и другие.
Слайд 7К макроэлементам (биогенным) относятся десять элементов, содержащихся в основных биополимерах
всех организмов: С, O, H, N, S, P, K, Ca,
Mg, Fe. Микроэлементы включают в себя Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, Ba, B, Cr, Na, Se, Si, W и другие, однако в них нуждаются не все организмы.
Слайд 8Некоторые виды микроорганизмов не способны сами синтезировать отдельные органические вещества:
аминокислоты, азотистые основания, витамины, вследствие чего не могут расти при
их отсутствии в питательной среде. Такие соединения являются для них факторами роста. Микроорганизмы, нуждающиеся в определенном факторе роста, называются ауксотрофными в отличие от прототрофных, которые способны синтезировать все необходимые для них соединения.
Слайд 9По способу поступления питательных веществ в клетки микроорганизмов различают два
типа питания: осмотрофное и фаготрофное. Подавляющее большинство микроорганизмов питается по
осмотрофному типу: поглощают растворенные в воде вещества. Фаготрофное питание у большинства микроорганизмов невозможно, так как их клетки имеют ригидные клеточные стенки, и поэтому они не способны захватывать твердые частицы.
Слайд 10В зависимости от того, какие питательные вещества – органические или
неорганические – являются донорами электронов, все микроорганизмы также подразделяют на
две группы. Органотрофными являются организмы, использующие в качестве доноров электронов органические соединения, к литотрофным относятся организмы, способные использовать в качестве доноров электронов неорганические вещества (H2, NH3, H2S, CO, Fe2+ и т. д.).
Слайд 12Среди бактерий выделяют:
1) прототрофы (способны сами синтезировать необходимые вещества из более
простых соединений);
2) ауксотрофы (являются мутантами прототрофов, потерявшими гены; ответственны за синтез
некоторых веществ - витаминов, аминокислот, поэтому нуждаются в этих веществах в готовом виде).
Слайд 13Метаболиты и ионы поступают в микробную клетку различными путями.
Пути поступления
метаболитов и ионов в микробную клетку.
1. Пассивный транспорт (без энергетических затрат):
1) простая
диффузия;
2) облегченная диффузия (по градиенту концентрации, с помощью белков-переносчиков).
2. Активный транспорт (с затратой энергии, против градиента концентрации; при этом происходит взаимодействие субстрата с белком-переносчиком на поверхности цитоплазматической мембраны).
Слайд 15Встречаются модифицированные варианты активного транспорта - перенос химических групп. В
роли белков-переносчиков выступают фосфорилированные ферменты, поэтому субстрат переносится в фосфорилированной
форме. Такой перенос химической группы называется транслокацией.
Слайд 16Особенности метаболизма у бактерий:
1) многообразие используемых субстратов;
2) интенсивность процессов метаболизма;
3) направленность всех процессов
метаболизма на обеспечение процессов размножения;
4) преобладание процессов распада над процессами синтеза;
5) наличие
экзо- и эндоферментов метаболизма.
Слайд 18В процессе метаболизма выделяют два вида обмена:
1) пластический (конструктивный):
а) анаболизм (с затратами
энергии);
б) катаболизм (с выделением энергии);
2) энергетический обмен (протекает в дыхательных мезосомах):
а) дыхание;
б) брожение.
Слайд 19В зависимости от акцептора протонов и электронов среди бактерий различают
аэробы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы.
Слайд 20Факультативные анаэробы в кислородных условиях используют процесс дыхания, в бескислородных
- брожение. Для облигатных анаэробов характерно только брожение, в кислородных
условиях наступает гибель микроорганизма из-за образования перекисей, идет отравление клетки.
Слайд 21Токсичность молекулярного кислорода для анаэробных бактерий связана с отсутствием в
их клетках механизмов, обеспечивающих детоксикацию сильных окислителей, которые образуются в
его присутствии в процессе развития.
Многие клетки синтезируют ферменты каталазу и пероксидазу, защищающие их содержимое от токсичного действия радикалов кислорода:
Слайд 23В микробной клетке ферменты являются биологическими катализаторами. По строению выделяют:
1) простые
ферменты (белки);
2) сложные; состоят из белковой (активного центра) и небелковой частей;
необходимы для активизации ферментов.
Слайд 24Различают также:
1) конституитивные ферменты (синтезируются постоянно независимо от наличия субстрата);
2) индуцибельные ферменты
(синтезируются только в присутствии субстрата).
Слайд 25По месту действия выделяют:
1) экзоферменты (действуют вне клетки; принимают участие в
процессе распада крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь бактериальной
клетки; характерны для грамположительных бактерий);
2) эндоферменты (действуют в самой клетке, обеспечивают синтез и распад различных веществ).
Слайд 27Основными видами пластического обмена являются:
1) белковый;
2) углеводный;
3) липидный;
4) нуклеиновый.
Слайд 28Белковый обмен характеризуется катаболизмом и анаболизмом. В процессе катаболизма бактерии
разлагают белки под действием протеаз с образованием пептидов.
Под действием
пептидаз из пептидов образуются аминокислоты.
Распад белков в аэробных условиях называется тлением, в анаэробных - гниением.
Слайд 29В результате распада аминокислот клетка получает ионы аммония, необходимые для
формирования собственных аминокислот. Бактериальные клетки способны синтезировать все 20 аминокислот.
Ведущими из них являются аланин, глютамин, аспарагин. Они включаются в процессы переаминирования и трансаминирования.
Слайд 30В углеводном обмене у бактерий катаболизм преобладает над анаболизмом. Сложные
углеводы внешней среды могут расщеплять только те бактерии, которые выделяют
ферменты - полисахаридазы. Полисахариды расщепляются до дисахаров, которые под действием олигосахаридаз распадаются до моносахаров, причем внутрь клетки может поступать только глюкоза.
Слайд 31Часть ее идет на синтез собственных полисахаридов в клетке, другая
часть подвергается дальнейшему расщеплению, который может идти по двум путям:
по пути анаэробного распада углеводов - брожению (гликолизу) и в аэробных условиях - по пути горения.
Слайд 32В зависимости от конечных продуктов выделяют следующие виды брожения:
1) спиртовое;
2) пропионионово-кислое;
3) молочнокислое;
4) маслянокислое;
5) бутилденгликолевое.
Слайд 34Наряду с основным анаэробным распадом (гликолизом) могут быть вспомогательные пути
расщепления углеводов (пентозофосфатный, кетодезоксифосфоглюконатный и др.). Они отличаются ключевыми продуктами
и реакциями.
Слайд 35Липидный обмен осуществляется с помощью ферментов - липопротеиназ, летициназ, липаз,
фосфолипаз.
Липазы катализируют распад нейтральных жирных кислот, т. е. ответственны за отщепление
этих кислот от глицерина. При распаде жирных кислот клетка запасает энергию. Конечным продуктом распада является ацетил-КоА.
Слайд 36Нуклеиновый обмен бактерий связан с генетическим обменом. Синтез нуклеиновых кислот
имеет значение для процесса деления клетки. Синтез осуществляется с помощью
ферментов: рестриктазы, ДНК-полимеразы, лигазы, ДНК-зависимой-РНК-полимеразы.
Слайд 37Рестриктазы вырезают участки ДНК, убирая нежелательные вставки, а лигазы обеспечивают
сшивку фрагментов нуклеиновой кислоты. ДНК-полимеразы ответственны за репликацию дочерней ДНК
по материнской. ДНК-зависимые-РНК-полимеразы отвечают за транскрипцию, осуществляют построение РНК на матрице ДНК.
Слайд 39Под ростом понимают согласованное увеличение количества всех химических компонентов, формирующих
клеточные структуры. Рост клеток обычно сопровождается увеличением их массы и
размеров. Однако эта закономерность наблюдается не всегда, так как в некоторых условиях клетки способны просто накапливать запасные или резервные вещества, т. е. масса может увеличиваться, но роста при этом не наблюдается.
Слайд 40Иными словами, культуры, растущие сбалансированно, сохраняют постоянный химический состав. В
условиях сбалансированного роста легко определить величину скорости роста бактериальной популяции
в каждый момент времени, если измерить прирост любого компонента клетки по отношению к его исходному количеству.
Удельную скорость роста можно рассчитать по следующим формулам:
Слайд 41 Кривая роста бактериальной популяции: 1 – лаг-фаза; 2 –
экспоненцальная фаза; 3 – стационарная фаза; 4 – фаза отмирания
Слайд 42Лаг-фаза, или фаза задержанного роста, охватывает промежуток времени между инокуляцией
бактерий и достижением ими максимальной скорости деления. В клетках бактерий
в этот период идут в основном процессы, связанные с приспособлением их к условиям культивирования (составу среды, температуре, рН и т. п.).
Слайд 43Фаза экспоненциального (логарифмического) роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток
и скоростью роста. Для различных видов бактерий эти величины могут
варьировать в значительных пределах. Например, бактерии
E. coli при 37 ºС делятся примерно каждые 20 мин, а бактерии родов Nitrosomonas и Nitrobacter – 5–10 ч. Культуры бактерии E. coli вступают в стационарную фазу при концентрации клеток 2–5 . 109/мл.
Слайд 44Стационарная фаза наступает тогда, когда число жизнеспособных клеток достигает максимума
и не увеличивается, так как скорость размножения бактерий равна скорости
их отмирания.
Слайд 45В стационарную фазу роста поведение клеток в бактериальной популяции может
регулировать явление, которое получило название апоптоз. Суть его сводится к
тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция бактерий разделяется на две субпопуляции, одна из которых погибает и подвергается автолизу, клетки же другой популяции, используя продукты автолиза как субстрат, продолжают размножаться.
Слайд 46В фазе отмирания происходит экспоненциальное снижение числа живых клеток. Скорость
отмирания бактерий существенно варьирует в зависимости от условий среды и
физиологических особенностей организма.
Слайд 47Культивирование иммобилизованных клеток микроорганизмов находит широкое применение в биотехнологии, а
именно в производстве ценных органических веществ, в деградации токсичных природных
и неприродных соединений, а также промышленных отходов, для очистки сточных вод от загрязнений.
Слайд 48Под иммобилизацией понимают такую процедуру, в результате которой молекула фермента
тем или иным способом прикрепляется к определенным объектам (носителей), нерастворимых
в воде. Эти объекты вместе с ферментом легко отделяются от раствора после завершения реакции. Химическое «пришивание» фермента к носителю закрепляет конформацию фермента, и является причиной повышения устойчивости и снижения лабильности.
Слайд 49Первым иммобилизованным ферментом, примененным в промышленном масштабе, была аминоацилаза. Она
была использована в Японии в 1969 г. для производства аминокислот,
добавляемых в корм животных. На мировом рынке эта продукция пользуется большим спросом.
Слайд 50Преимущества использования иммобилизованных ферментов:
1. Чистые препараты ферментов неустойчивы при длительном
хранении.
2. Многократное использование ферментов затруднено в промышленных условиях, т.к. их
сложно отделить от реагентов.
Слайд 51Иммобилизованный (гетерогенный) катализатор легко отделить от реакционной среды. Это обусловливает:
1)
возможность остановки реакции в любой нужный момент:
2) повторное использование катализатора;
3)
получение конечного продукта, не загрязнённого ферментом.
Слайд 52Иммобилизация фермента даёт возможность регулировать их каталитическую активность за счёт
изменения свойств носителя.
Иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду,
в которой для него доступной оказывается лишь ограниченная часть общего объёма.
Слайд 53Все существующие методы физической иммобилизации (т.е. иммобилизации, при которой фермент
не соединяется с носителем ковалентными связями, могут быть подразделены на
четыре группы:
Слайд 541) адсорбция на поверхности нерастворимого носителя;
2) включение в поры геля;
3)
пространственное разделение фермента от остальной части с помощью полупроницаемой мембраны;
4)
введение фермента в двухфазную реакционную среду, в которой он растворим, но может находиться только в одной из фаз.
Слайд 56Основные требования, которым должны соответствовать носители:
- Высокая химическая и биологическая
стойкость;
- Высокая механическая прочность;
- Достаточная проницаемость для фермента и субстратов;
-
Высокая пористость;
- Возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран, труб, листов и т.д.);
Слайд 57- Легкое перевода в реакционно-способную форму (активация):
- Высокая гидрофильность, которая
обеспечивает возможность проведения реакции связывания фермента с носителем в водной
среде;
- Невысокая стоимость.
Слайд 58В зависимости от природы носители делятся на:
1. Органические материалы;
2. Неорганические
материалы.
Органические полимерные носители можно разделить на 2 класса:
а) природные;
б) синтетические.
В свою очередь, каждый из классов органических полимерных носителей подразделяется на группы в зависимости от их строения. Среди природных полимеров выделяют: белковые; полисахаридные; липидные носители, а среди синтетических: полиметиленовые; полиамидные; полиэфирные носители.
Слайд 59
К преимуществам природных носителей следует отнести:
Доступность;
2. Полифункциональность;
3. Гидрофильность,
а
к недостаткам – высокую стоимость.
Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто
используют: целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для придания химической устойчивости их линейные цепи поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сетчатые структуры легко вводят различные ионогенные группировки.
Слайд 60Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин,
который в значительных количествах накапливается в виде отходов в процессе
промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру.
Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие как: кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена – желатин.
Слайд 61Синтетические полимерные носители включают полимеры на основе стирола, акриловой кислоты,
поливинилового спирта, полиамидные и полиуретановые поли меры.
Их преимущество:
1.
Механическая прочность;
2. Возможность варьирования в широких пределах величины пор и введения различных функциональных групп.
Синтетические полимеры воспроизведены в таких изделиях, как трубы, волокна, гранулы. Все эти свойства полезны для разных способов иммобилизации ферментов.
Слайд 62Носители неорганической природы представляют собой материалы изготовленные из стекла, глины,
керамики, графитовой сажи, а также оксиды металлов. Их можно подвергать
химической модификации, для чего носители покрывают плёнкой оксидов алюминия, титана, циркония. Или обрабатывают органическими полимерами.
Преимущество неорганических носителей:
лёгкость регенерации.
Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.
Слайд 63При адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за
счёт электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей.
Слайд 64Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется пористостью носителя. Процесс
адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается
при контакте водного раствора фермента с носителем при перемешивании. С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях.
Слайд 65Иммобилизация ферментов путём включения в гель.
Способ иммобилизации ферментов путём
включения в трёхмерную структуру полимерного геля широко распространён благодаря своей
простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но даже отдельных клеток. иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами:
Слайд 661. Фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят
полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с
включёнными в его ячейки молекулами фермента.
2. Фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние.
Для первого варианта используют гели: полиакриламида, поливинилового спирта, силикагеля. Для второго: гели крахмала, агар-агара, агарозы, фосфата кальция.
Слайд 67Метод инкапсулирования разработан в 1974 г. и состоит в том,
что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой
образованы полупроницаемым полимером. Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонсистенции двух соединений, одно из которых растворено с водой, а другое – в органической фазе.
Размер получаемых капсул составляет сотни микрометров, а толщина мембраны - сотые доли микрометра.
Слайд 68Метод включения водных растворов ферментов в липосомы
Впервые данный метод был
применён для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в
1970 году. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель.
Слайд 69Оставшуюся тонкую плёнку липидов выдерживают в водном растворе, содержащем фермент.
В процессе выдержки происходит самосборка липидных структур липосомы, содержащих данный
раствор фермента.
Ферменты, иммобилизованные путём включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и биотехнологических целях.
Слайд 70Химические методы иммобилизации ферментов.
Представляют иммобилизацию ферментов путём образования новых
ковалентных связей между ферментом и носителем – наиболее массовый способ
получения промышленных биокатализаторов.
В отличие от физических вариантов, эти методы иммобилизации обеспечивают прочную и необратимую связь фермента с носителем и сопровождаются стабилизацией молекулы энзима.