Разделы презентаций
- Разное
- Английский язык
- Астрономия
- Алгебра
- Биология
- География
- Геометрия
- Детские презентации
- Информатика
- История
- Литература
- Математика
- Медицина
- Менеджмент
- Музыка
- МХК
- Немецкий язык
- ОБЖ
- Обществознание
- Окружающий мир
- Педагогика
- Русский язык
- Технология
- Физика
- Философия
- Химия
- Шаблоны, картинки для презентаций
- Экология
- Экономика
- Юриспруденция
БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
Содержание
- 1. БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747
- 2. ПЦР в реальном времениПЦР в реальном времени
- 3. ПЦР в реальном времени
- 4. Способы детекции сигнала при проведении ПЦР
- 5. Фазы ПЦР
- 6. Классификация ПЦР-РВ по способу снятия сигнала
- 7. Точки сбора данных для различных видов анализа
- 8. ОТЛИЧИЕ АНАЛИЗА ПРОДУКТОВ ПЦР «ПО КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ»
- 9. Во время прохождения стандартной ПЦР не нарабатывается видимого сигналаНакопление ПЦР-продукта нужно каким-то образом визуализировать.Визуализация накопления ПЦР-продуктаФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ!!!
- 10. Интеркалирующие красители. SYBR GreenСвязывается с малой бороздкой
- 11. Достоинства интеркалирующих красителей:ДешевизнаПростота в использованииНедостатки интеркалирующих красителей:-Недостаточная
- 12. А. Флюорофор связан с ДНК и флюоресцирует.Б.
- 13. Флюорофоры – небольшие химические соединения ароматической природы.Гасители – небольшие химические соединения ароматической природы.
- 14. Флюорофоров бывает много!
- 15. Меченые праймеры с адаптерной последовательностью («амплифлюры»)а —праймер
- 16. Вытесняющие пробыВытесняющая проба - пара частично комплементарных
- 17. Молекулярные маячки (molecular beacons – молекулярный бекон!)Пробы
- 18. Вы думали, здесь будет еще один вариант
- 19. Линейные разрушаемые пробы (TaqMan)Пробы несут флуорофор и
- 20. ПЦР в реальном времени – количественный метод!Идеальная
- 21. Регистрируется не количество молекул ДНК, а флюоресцентный
- 22. Господи Иисусе, как же все это можно
- 23. Участки кривой накопления флюоресцентного сигналаЛинейная шкала
- 24. Сравнение нескольких реакций ПЦР пороговым методомМожно ли сделать это в одной пробирке?
- 25. Мультиплексная ПЦР в реальном времениПросто добавьте зонты
- 26. Скачать презентанцию
ПЦР в реальном времениПЦР в реальном времени – метод, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременной детекцией сигнала, генерируемого в ходе проведения ПЦР.
Слайды и текст этой презентации
Слайд 8ОТЛИЧИЕ АНАЛИЗА ПРОДУКТОВ ПЦР «ПО КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ» И «В РЕАЛЬНОМ
ВРЕМЕНИ»
Несмотря на различие в конечной концентрации продуктов реакции, появление регистрируемого
прибором сигнала для всех пробирок произошло одновременно, что свидетельствует о схожести начального количества ДНК.
Слайд 9Во время прохождения стандартной ПЦР не нарабатывается видимого сигнала
Накопление ПЦР-продукта
нужно каким-то образом визуализировать.
Визуализация накопления ПЦР-продукта
ФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ!!!
Слайд 10Интеркалирующие красители.
SYBR Green
Связывается с малой бороздкой ДНК.
Окрашивает любую двуцепочечную ДНК.
Интенсивность флуоресцентного сигнала SYBR Green пропорциональна количеству наработавшегося двуцепочечного продукта
реакции.
Слайд 11Достоинства интеркалирующих красителей:
Дешевизна
Простота в использовании
Недостатки интеркалирующих красителей:
-Недостаточная точность (сигнал от
димеров праймеров!)
-Невозможность проведения мультиплексной ПЦР
Чтобы компенсировать эти недостатки, были придуманы
системы «флюорофор – гаситель».
Слайд 12А. Флюорофор связан с ДНК и флюоресцирует.
Б. Флюорофор и гаситель
связаны с ДНК в непосредственной близости друг от друга. Энергия
передается с флюорофора на гаситель и испускается последним с другой длиной волны (флюоресцирующий гаситель).В. Флюорофор и гаситель связаны с ДНК в непосредственной близости друг от друга. Энергия передается с флюорофора на гаситель и диссипирует (темновой гаситель).
Слайд 13Флюорофоры – небольшие химические соединения ароматической природы.
Гасители – небольшие химические
соединения ароматической природы.
Слайд 15Меченые праймеры с адаптерной последовательностью («амплифлюры»)
а —праймер содержит 5'-адаптер с
инвертированным повтором, по краям которого расположены флуорофор и гаситель. При
температуре элонгации инвертированный повтор образует шпилечную структуру, в которой флуорофор и гаситель сближены. В ходе синтеза второй цепи ДНК шпилечная структура«разворачивается» и интенсивность флуоресценции возрастает.
б — праймер содержит меченый 5'-адаптер, комплементарный дополнительному олигонуклеотиду с гасителем. Синтез второй цепи «сталкивает» олигонуклеотид с гасителем.
Слайд 16Вытесняющие пробы
Вытесняющая проба - пара частично комплементарных друг другу олигонуклеотидов,
один из которых несет флуорофор, а другой — гаситель флуоресценции.
В
отсутствие мишени проба образует дуплекс, в котором флуоресценция подавлена. При накоплении соответствующего пробе продукта реакции процесс реассоциации пробы начинает конкурировать с процессом гибридизации олигонуклеотидов на мишень, что ведет к увеличению уровня флуоресценции.! Проба – это не праймер!
С пробы амплификация не идет, она просто с чем-нибудь связывается.
Слайд 17Молекулярные маячки
(molecular beacons – молекулярный бекон!)
Пробы несут короткий инвертированный
концевой повтор, по краям которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции.
В растворе пробаформирует шпилечную структуру, в которой флуорофор и гаситель
сближены.
При гибридизации со специфичным продуктом реакции проба «разворачивается», что ведет к разобщению флуорофора и гасителя и, как следствие, к усилению флюоресценции.
Слайд 18Вы думали, здесь будет еще один вариант флюоресцентной детекции?
А вот
и нет!
5’-экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Активность эта «биоинженерная» - в рекомбинантный белок
добавлен соответствующий домен.
Слайд 19Линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
Пробы несут флуорофор и гаситель флуоресценции. Пока
проба находится в растворе, за счет близкого расположения гаситель эффективно
поглощает энергию флуорофора. В случае гибридизации со специфичным продуктом реакции проба разрушается за счет 5'-экзонуклеазной активности полимеразы, что ведет к разобщению флуорофора и гасителя и возрастаниюфлуоресценции.
Слайд 20ПЦР в реальном времени – количественный метод!
Идеальная ПЦР:
n—номер цикла реакции;
N0—количество целевых молекул в начале реакции (на первом цикле);
Nn—количество
продуктов реакции на цикле n; 2 — коэффициент эффективности ПЦР.
Реалистическая ПЦР:
Е – коэффициент эффективности, находящийся в интервале от 1 до 2.
Отличие значения Е всего на 0,15 к 30-му циклу ПЦР дает разницу в количестве продукта в 10 раз!
Слайд 21Регистрируется не количество молекул ДНК, а флюоресцентный сигнал!
F - сигнал
флуоресценции;
а - (неизвестный) коэффициент пропорциональности;
N - число молекул
ДНК.Коэффициент а зависит от:
- настроек прибора, параметров реакционной
пробирки, точности разнесения реактивов по пробиркам и т. д.
системы визуализации накопления ДНК (интеркалирующие красители, олигонуклеотидные зонды, меченые праймеры и т. д.).
При сравнении разных экспериментов или даже разных пробирок внутри одного эксперимента полученные данные нельзя сравнивать напрямую: коэффициент для них может отличаться.
Слайд 22Господи Иисусе, как же все это можно посчитать?!
(Да, в общем-то,
довольно просто).
Пороговый метод: определение момента Ct (выраженного в циклах ПЦР),
когда количество ДНК в реакционной пробирке (а следовательно, и флуоресцентный сигнал) достигает одинаковой для всех образцов пороговой величины Nt (задается пользователем или программным обеспечением). Сравнивая полученные значения Ct, можно судить о начальных концентрациях ДНК в исследуемых образцах.Для корректной работы порогового метода, необходимым является сходство коэффициентов преобразования уровня флуоресценции в количество ДНК.
Слайд 23Участки кривой накопления флюоресцентного сигнала
Линейная шкала
Логарифмическая шкала
Информативен только экспоненциальный
участок!
Слайд 25Мультиплексная ПЦР в реальном времени
Просто добавьте зонты с разной шириной
волны испускаемой тьмы к разным молекулам ДНК и используйте прибор
с возможностью детекции нескольких глубин волн – и все у вас будет ништяк!
