Эпигеномная регуляция процессов эмбрионального развития Млекопитающих Семенова

Биологический ф-т МГУ им. М.В.Ломоносова


Москва - 2020

окраска клонированной и исходной кошки

– Барр и Бертрам описали хроматиновые тельца

1959 – Ohno: это

тельце-одна из двух хромосом самки

1961 – Мэри Лайон: эксперименты, демонстрирующие случайную инактивацию Х-хромосомы

Х-хромосоме района, отвечающего за инактивацию прилегающих участков хромосомы – центра

инактивации Хic. Это предположение было сделано на основании того, что при встраивании некоторых фрагментов Х-хромосомы в состав неполовых хромосом (аутосом) происходит выключение примыкающих к месту интеграции аутосомных генов. По-видимому, такая «гибридная» хромосома, несущая центр инактивации Xic, воспринимается клеткой как еще одна Х-хромосома и учитывается при «расчете» дозы генов.
Таким образом, центр инактивации Xic является «визитной карточкой» Х-хромосомы для систем клетки. Центр инактивации Xic содержит элементы, отвечающие за подсчитывание всех Х-хромосом (центров Xic), а так же за выбор будущей единственной активной Х-хромосомы.

Делеция элементов, ответственных за выбор, приводит к преимущественной инактивации Х-хромосом с интактным центром Xic;

Повреждение счетных элементов центра Xic вызывает инактивацию единственной Х-хромосомы в клетках с кариотипом Х0 и ХY.

http://www.bionet.nsc.ru/labs/epigenetics/?page_id=304

В центре инактивации Xic расположен ген Xist (X-inactive specific transcript), продуктом которого является функциональная РНК, которая на ранних этапах инактивации необходима и достаточна для «выключения» генов Х-хромосомы.

Активность гена Xist негативно регулируется геном Tsix. Эти гены частично перекрываются между собой (каждая цепь участка двуцепочечной ДНК несет свою информацию) что отражено в названии последнего - Tsix, это Xist наоборот.

Помимо этих двух генов в центре инактивации обнаружено еще 9 генов, для которых роль в процессе Х-инактивации пока не до конца ясна

Центр инактивации Х-хромосомы (Xic)

эмбрионах в ТЭ и ПЭ всегда выключаются отцовская, но не

материнская Х-хромосома
Но почему в ХУ эмбрионах не выключается единственная Х-хромосома?

В Х-хромосоме, полученной от матери, есть импринт, блокирующий экспрессию Xist, (но не за счет метилирования). Этот импринт, вероятно, связан с модификациями гистонов и устанавливается во время созревания ооцитов.
В Х-хромосоме, полученной от отца, в области промотора Xist есть низкометилированные СрG-участки, деметилирование в них происходит во время сперматогенеза.

В ХХ эмбрионах инактивируются все Х-хромосомы, кроме одной (у тетраплоидных мышиных эмбрионов выключаются 3 из 4-х Х-хромосом). Почему?
В ХУ эмбрионах не выключается единственная Х-хромосома

Теория “блокирующего фактора”
Есть некий фактор (неизвестной природы), который связывается с Х-хромосомой в зоне Хic и блокирует экспрессию гена Xist. Разные аллели Xic имеют разное сродство к этому фактору. Если аллель одна, то фактор связывается с ней (нет конкуренции) и Хist инактивируется.

“Или неслучайная?”

Влияние Tsix: делеции в промоторе Tsix приводят к предпочтительной инактивации этой хромосомы. Вероятно, образование Xist-Tsix (по принципу сенс-антисенс) двуцепочечных РНК.
В реконструированный ХХ эмбрионах (2 отцовских или 2 материнских пронуклеуса – так называемые андрогенетические и гиногенетические эмбрионы) нарушаются паттерны инактивации Х-хромосом
У мышей на Х-хромосоме есть локус Xce (Х-controlling element). Его аллели влияют на вероятность того, инактивируется эта хромосома или нет.

У сумчатых – Х-инактивация только по принципу импринтига (всегда выключена отцовская X-хромосома) и нет Xist!!!! (? Другая некодирующая РНК с той же функцией?)
У мыши – в ТЭ и ПЭ – импринтинг, остальные ткани – случайный механизм
У человека?

95% генов на инактивированной Х-хромосоме неактивны, а остальные имеют сниженный

уровень активности
У человека:
только 75% генов инактивированной Х-хромосомы неактивны,
15% генов инактивации, а еще 10% генов – инактивированы частично

Гены в псевдоаутосомной части инактивированной Х-хромосомы преимущественно активны

Паттерн инактивации изменяется в ходе онтогенеза: происходит постепенная активация части генов

не т олько в последовательности ДНК.

2) Роль регуляторов громкости, усиливающих

или ослабляющих действие генов, выполняют эпигенетические факторы.

3)Носителями эпигенетической информации служат химические группы, связанные с ДНК или гистонами, регулирующими упаковку ДНК в составе хромосом

4)Модификация белков обеспечивает более краткую эпигенетическую регуляцию, модификация ДНК – более длительную

цитозин здесь прометилирован:
5'-ACGTAT5-MeCGT-3'
3'-TGCATAG5-MeCA-5'
2. Репликация ДНК: метилированность сама по себе

не реплицируется, временная пассивная деметилизация ДНК
5'-ACGTAT5-MeCGT-3'
3'-TGCATAGCA-5'

5'-ACGTATCGT-3'
3'-TGCATAG5-MeCA-5‘
3.   Метилирование цитозина поддерживающей метилазой в паре 3'-GC-5' (метилирование цитозина производится только в том случае, если напротив 3'-GC-5' в комплементарной цепи ДНК есть 5'-CG-3' с прометилированным C).
5'-ACGTAT5-MeCGT-3'
3'-TGCATAG5-MeCA-5'
5'-ACGTAT5-MeCGT-3'
3'-TGCATAG5-MeCA-5'
 
    Таким образом, модифицированный цитозин может наследоваться подобно обычному, передавая свою метилированность в дочернюю цепь ДНК.

Метилирование ДНК осуществляется ДНК-метилтрансферазами

Наследование уровня метилирования в ряду поколений клеток

дифференциально маркирующий материнские и отцовские гомологичные хромосомы и приводящий к

разному фенотипическому проявлению мутаций у потомства, унаследованных от матери или отца.
(от “imprint” — отпечаток)



Когда в соматических клетках проявляется изменение транскрипционной активности импринтированного гена в зависимости от его происхождения (материнский или отцовский), то говорят об
“эпиаллеле”

протаминов на гипометилированные гистоны;
материнский пронуклеус – сильнее метилирован и

содержит ацетилированные гистоны

transcription factor gene E74-like factor 5 (Elf5) метилируется и блокируется

его экспрессия

В отсутствие Elf5 блокируется экспрессия Cdx2 и eomesodermin (Eomes)

При нарушении метилирования (DNA methyltransferase 1 (Dnmt1)-knockout cells) - Elf5 включен.

Результат: разрешены дифференцировки клеток по внезародышевому типу

перееданию (ожирение);
пониженный мышечный тонус (гипотонус); пониженная координация движений;
маленькие

кисти и стопы, низкий рост;
повышенная сонливость;
косоглазие; сколиоз; пониженная плотность костей; гипогонадизм (бесплодие);
речевая задержка, задержка психического развития;
более позднее половое созревание.

проблемы с питанием, плохо набирают вес;
задержка в развитии навыков общей моторики (умение сидеть, ходить);
задержка речевого развития, неразвитая речь
гиперактивность;
эпилепсия;
ходьба на негнущихся ногах — из-за этой особенности детей с этим синдромом иногда сравнивали с марионетками
нарушения сна;
косоглазие в 40 % случаев;
сколиоз в 10 % случаев;
повышенная чувствительность к высокой температуре;

однородительскими дисомиями
Фенотипический эффект ОРД по какой-либо хромосоме набора выявляется

лишь в том случае, если эта хромосома несет импринтированные локусы

eLife 2015;4:e11389. DOI: 10.7554/eLife.11389
Sister kinetochore splitting and precocious disintegration of

bivalents could explain the maternal age effect
Agata P Zielinska1, Zuzana Holubcova1, Martyn Blayney2, Kay Elder2, Melina Schuh1,3*
1 Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, United
Kingdom;
2 Bourn Hall Clinic, Cambridge, United Kingdom;
3 Max Planck Institute for
Biophysical Chemistry, Goettingen, Germany

eLife 2015;4:e11389. DOI: 10.7554/eLife.11389

the maternal age effect
Agata P Zielinska1, Zuzana Holubcova1, Martyn

Blayney2, Kay Elder2, Melina Schuh1,3*
1 Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, United
Kingdom;
2 Bourn Hall Clinic, Cambridge, United Kingdom;
3 Max Planck Institute for
Biophysical Chemistry, Goettingen, Germany

Zielinska et al. eLife 2015;4:e11389. DOI: 10.7554/eLife.11389

(2008) 112–119

конкуренции их промоторов за доступ к общему энхансеру
На хромосоме

матери энхансер активирует транскрипцию гена H19, с которого считывается нетранслируемая РНК, а ген IGF2 находится в неактивном состоянии.

На хромосоме отца в результате метилирования локуса H19 ген IGF2 становится доступным для энхансера и активируется.

ОРД по сегменту 11р15.5 отцовского происхождения приводит к двойной дозе гена IGF2,

мутация в материнском аллеле, при котором активируется IGF2 - тот же эффект

Синдром Беквита-Видемана:

http://www.beckwith-wiedemann.info/protocol_russ.html

отсутствует у однопроходных млекопитающих (эволюционная дистанция с териями – 180млн.

лет)

Геномный импринтинг обнаруживается у сумчатых и плацентарных млекопитающих (эти группы разошлись 150 млн. лет назад)

плаценте человека (ворсинки хориона)
Buckberry S, Bianco-Miotto T, Hiendleder S, Roberts

CT (2012) Quantitative Allele-Specific Expression and DNA Methylation Analysis of H19, IGF2 and IGF2R in the Human Placenta across Gestation Reveals H19 Imprinting Plasticity. PLoS ONE 7(12): e51210. doi:10.1371/journal.pone.0051210
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0051210

Для анализа экспрессии Н19 и IGF2 использовали ворсинки хориона плодов гетерозиготных по SNP (т.е. несущих разные аллели)

H19 transcription start site (TSS).
Buckberry S, Bianco-Miotto T, Hiendleder S,

Roberts CT (2012) Quantitative Allele-Specific Expression and DNA Methylation Analysis of H19, IGF2 and IGF2R in the Human Placenta across Gestation Reveals H19 Imprinting Plasticity. PLoS ONE 7(12): e51210. doi:10.1371/journal.pone.0051210
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0051210

modulated when tissues undergo repair and differentiation, and are subjected

to carcinogens, cytokines, growth factors and stress conditions. H19 gene expression is also modulated by p53 transcription factor and HGF/SF stromal factor

H19 RNA. A reduced expression of adhesion molecules responsible for

cell-cell and cell-matrix interactions together with the up regulation of genes required for extracellular-matrix metabolism, motility, and angiogenesis put H19 gene function in the core of at least the initial steps of metastatic cascade.

от РНК-вирусов) или microRNA (получается из собственной РНК-предшественника). Эти процессированные

РНК попадают в RISC (RNA-induced silencing complex), который разрушает мРНК и предотвращает трансляцию.

РНК-интерференция (RNAi) 

Собственные интерферирующие РНК:
1) миРНК (MicroRNA) - пост транскрипционный сайленсинг (глушение) гена
2) пиРНК (Piwi-interacting RNA) – управляют уровнем метилирования ДНК (у млекопитающих)

от РНК-вирусов) или microRNA (получается из собственной РНК-предшественника). Эти процессированные

РНК попадают в RISC (RNA-induced silencing complex), который разрушает мРНК и предотвращает трансляцию.

РНК-интерференция (RNAi) 

Собственные интерферирующие РНК:
1) миРНК (MicroRNA) - пост транскрипционный сайленсинг (глушение) гена
2) пиРНК (Piwi-interacting RNA) – управляют уровнем метилирования ДНК (у млекопитающих)

to premiRNAs and Dicer cleaves them to form mature, double-stranded

miRNAs.

The miRNAs are then loaded onto AGO proteins, which along with TNRC6 proteins form the RISC complex.

The passenger strand of the
miRNA is removed to form an active complex which can then target and bind to the 3’ untranslated regions of mRNAs.

This binding leads to translational repression.

Nucleic Acids Research, 2016, Vol. 44, No. 2

Схема РНК-интерференции в цитоплазме клеток млекопитающих

rate of transcription, and alters alternative splicing.






(B) Binding of

an RNA:RNAi factor complex near a splice site blocks association of the spliceosome and redirects alternative splicing.

Kalantari et al Nucleic Acids Research, 2016, Vol. 44, No. 2

Схема возможного механизма RNAi контроля альтернативного сплайсинга

2013 April 01.
Участие PIWI-белков в метилировании de novo
в половых

клетках эмбриона мыши

Два Piwi – белка (или белка-аргонавта), MILI и MIWI2, локализованные в цитоплазматических гранулах, участвуют в пинг-понг механизме, который амплифицирует piRNA, которые связываются с активными мобильными элементами (транспазонами).
Результат: стабилизация генома в период деметилирования

В половых клетки эмбриона “снимается” метилирование генома

Когда высокий процент ДНК – в деметилированном состоянии активность транспазонов может привести к серьезным повреждениям генома

Существует механизм блокировки активности транспазонов
(пинг-понг механизм или пинг-понг цикл пиРНК амплификации)

представить такой моделью:

первичное накопление одноцепочечных молекул РНК, пиРНК-прекурсоров;

созревание пиРНК и их амплификация с помощью пиви-белков (пинг-понг цикл);

Схема пинг-понг цикла пиРНК амплификации

Ядро

Цитоплазма

a result of
epigenetic regulation of transposable elements

in the nucleus. Dicer and TRBP bind to premiRNAs
and Dicer

cleaves them to form mature, double-stranded miRNAs.
The miRNAs are then loaded onto AGO proteins, which along with
TNRC6 proteins form the RISC complex. The passenger strand of the
miRNA is removed to form an active complex which can then target and
bind to the 3 untranslated regions of mRNAs. This binding leads to translational
repression.

Nucleic Acids Research, 2016, Vol. 44, No. 2

RNA-mediated binding of AGO1 alters histone
modifications, affects the rate of

transcription, and alters alternative
splicing. (B) Binding of an RNA:RNAi factor complex near a splice site
blocks association of the spliceosome and redirects alternative splicing.

Kalantari et al Nucleic Acids Research, 2016, Vol. 44, No. 2

2013 April 01.
Участие PIWI-белков в метилировании de novo в половых

клетках эмбриона мыши

Two Piwi proteins, MILI
and MIWI2, localize to cytoplasmic granules and participate in the ping-pong mechanism
that amplifies piRNAs that target active transposable elements.

ДНК – в деметилированном состоянии

Активность транспазонов

Механизм блокировки активности транспазонов
(пинг-понг)

2010г.

и Бразилии (2004г.)
Клонированные животные живут меньше, чем обычные.

По некоторым данным, в клетках клонов укороченные теломерные участки.
Чтобы проверить, сократиться ли срок жизни клонов при повторном клонировании в яйцеклетки пересадили ядра из клеток клонов. При таком последовательном клонировании происходила коррекция длины теломер

one on the right is the clone.
Синдром генерализованного чрезмерного роста

клонированных мышей

Эпигенетические нарушения у клонированных эмбрионов:
Аномальное метилирование ДНК: в норме во время дробления проходит глобальное деметилирование и происходит активация “генов плюрипотентности”, в том числе Осt-4
Аномальный импритинг, дисрегуляция генов, нарушение структуры хроматина
Синдром крупного потомства
Преждевременная гибель

Профиль экспрессии у новорожденных клонированных мышей: нарушения в 4-5% генома, но в 30-50% импринтированных генов

cell fusion (pink) and transcription-factor transduction (green). These complementary approaches

have provided synergistic insights for almost 50 years and continue to inform the understanding of nuclear reprogramming and influence medical advances. EG cell, embryonic germ cell.

История открытий в области репрограммирования ядер

Nature 465, 704–712 (10 June 2010) doi:10.1038/nature09229

дифференцированным клеткам плюри/тотипотентности

клонированной бластоцисты выращивают культуру ЭСК и их ядра используют для

клонирования новых эмбрионов

Два разных подхода к получения клонированных эмбрионов:

Эффективность обеих методик низкая, но во втором случае можно сделать сотни попыток….

Успех -50%

Успех -50%

Успех -1-2%

Успех -1-2%

соматического ядра и технологии создания аллофенных химер.

NH et al., Development of transgenic cloned pig models of

skin inflammation by DNA transposon-directed ectopic expression of human β1 and α2 integrin. PLoS One. 2012;7(5).

“Гуманизированные”
животные

получении человеческих стволовых клеток из клонированных эмбрионов человека,
но его

работа оказалась подделкой.

Hwang WS, Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS, Hwang JH, Hwang YY, Park YS, Oh SK, Kim HS, Park JH, Moon SY, Schatten G. Patient-specific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocysts. Science. 2005 Jun 17;308:1777-83.

Hwang WS, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Park KY, Cibelli JB, Moon SY. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science. 2004 Mar;303:1669-74

Monk D. · Apostolidou S. · Stanier P. · Moore G. Cytogenet Genome Res

113:262–270 (2006) (DOI: 10.1159/000090841)

Abstract
Growth is defined as the progressive increase in size and is listed as one of the eight main characteristics of life. In human gestation the most rapid growth phase is from 16 to 32 weeks when first there is both cell number and size increase and then from 32 weeks onwards there is continued size increase (Pollack and Divon, 1992). The mechanism of growth in utero is of fundamental interest to clinicians and scientists because of its implications for neonatal health. Growth is multifactorial in origin with both genetics and environment contributing equally large parts. Despite this complexity analysis of the candidate genes involved is possible using simple tissue biopsies at the relevant stages of development. Of particular interest in understanding fetal growth is the analysis of a group of genes that show a parent-of-origin effect known as genomic imprinting. Imprinted genes are not only found in eutherian (placental) and metatherian (marsupial) mammals but surprisingly also in plants. Nevertheless, their evolution in mammals appears to be linked primarily to placentation. It is thought to result from a potential conflict between the parents in terms of the drive to successfully propagate their own separate genes and the mother’s added drive for her survival through the pregnancy to reproduce again. This means that the mother wants to restrict fetal growth and the father to enhance it.

клетках:

Самцы

1)
2)
3)

Самки
1)
2)
3)

Cytogenet Genome Res. 2006;113(1-4):36-40.
Origins of extreme sexual dimorphism in genomic imprinting.
Bourc'his D, Bestor TH.

Roughly equal numbers of imprinted genes are subject to repression from alleles of maternal and of paternal origin. This masks the strong sexual dimorphism that underlies major aspects of imprinted gene regulation. First, imprints are established very early in the male germ line and persist for the reproductive life of the organism, while maternal genomic imprints are established shortly prior to ovulation and are erased soon thereafter in the primordial germ cells of the next generation. Second, many CpG island-associated promoters are subject to maternal methylation but no known promoters are subject to paternal-specific germline methylation. The few known paternal methylation marks are kilobases distant from the affected genes and have a low CpG density. Third, Dnmt3L is required for imprint establishment but not transposon methylation in female germ cells, while Dnmt3L is required for transposon methylation and has only a minor role in de novo methylation at imprinted loci in male germ cells. Fourth, maternally expressed genes are commonly repressed on the paternal allele by paternally expressed imprinted genes produced in cis and encoding nontranslated RNAs. It is here suggested that rapid loss of highly mutable methylated CpG sites has led to the depletion of methylation target sites in paternally repressed imprinted genes, and that an imprinting mechanism based on RNAs or local inhibitory influences of ongoing transcription of regulatory loci has evolved to counter the erosion of paternally methylated regulatory regions. This mutability model is based on the fact that paternally methylated sequences are maintained in the methylated state for a much longer time than are maternally methylated sequences, and are therefore lost at a correspondingly faster rate. The difference in timing of imprint establishment is likely to underlie the increasing sexual dimorphism of other aspects of imprinted gene expression.