Курс лекций по энзимологии

биохимии МБФ РНИМУ им. Н.И.Пирогова,
Зав. лабораторией биоэлектрохимии ФГБУ «ИБМХ» им.

В. Н. Ореховича
Тел. 499 246 58 20; ком 354; корпус Б

процессов живых систем, интеграция химии, биологии, химической кинетики, химической технологии,

молекулярных аспектов ферментативного катализа, термодинамики биологических процессов.
Термин «фермент» (fermentum) происходит от латинского fervere - вскипать, пениться, и отражает процесс пенообразования при спиртовом брожении.

ферменты (энзимы) – белковые катализаторы различных процессов.
В курсе энзимологии

– науки о ферментах – мы будем изучать молекулярные и кинетические аспекты ферментативного катализа, биотехнологические и нанобиотехнологические процессы на их основе.
Развитие биотехнологии и генетической инженерии сделало возможным получение и производство ферментов с новыми свойствами в неограниченных количествах как для научных исследований, так и для практической медицины.

цепи, формирующей белки и ферменты, являются -аминокислоты. В природе известно

более 500 аминокислот, однако белки формируются из 20 -аминокислот. Реакция синтеза белков является реакцией поликонденсации, при которой образуются амидные (пептидные) связи между карбоксильной группой и аминогруппой аминокислоты. Реакция образования пептидной связи обратима. Константа равновесия К может быть вычислена на основании свободной энергии G реакции образования пептидной связи.
К=exp[Gº/(RT)]
Стандартная свободная энергия Gº = 18 кДж/моль для образования дипептида глицилглицина.

если свободная энергия Gº реакции отрицательно. Поэтому реальный синтез белков

в биосистемах идет с одновременным расходованием АТФ.
АТФ+Н2О=АДФ +Н3РО4, Gº = -34 кДж/моль
Разнообразие белковых структур колоссально, N=20n, где N – число возможных вариантов структур в белке, n- число аминокислот в белке.
Для белка, состоящего из 100 аминокислот, число возможных структур равно 20 100 = 10 130
Для сравнения: число нуклонов (протонов и нейтронов) во Вселенной составляет 1080 , что в 1050 меньше .

глобулярные белки, содержащие как регулярные участки, (-спирали и -листы), так

и нерегулярные области типа полимерных петель.
Основой белка является полипептидная цепь (первичная структура), в которой аминокислоты связаны ковалентной амидной (пептидной) связью.

природе известно более 500 различных аминокислот, одноко белки формируются из

20 -аминокислот. Белки, это биологические гетерополимеры, мономерами которых являются различные аминокислоты.
NH2 –CH(R) -COOH
В зависимости от вида радикала R основные аминокислоты делят на три группы:
1) неполярные (аланин, метионин, валин, пролин, лейцин, изолейцин, триптофан, фенилаланин);
2) полярные незаряженные (аспарагин, глутамин, серии, глицин, тирозин, треонин, цистеин);
3) полярные заряженные (аргинин, гистидин, лизин — положительно; аспарагиновая и глутаминовая кислоты — отрицательно).

гидрофобными или гидрофильными,
У растений все необходимые аминокислоты синтезируются из

первичных продуктов фотосинтеза. Человек и животные не способны синтезировать ряд протеиногенных аминокислот и должны получать их в готовом виде вместе с пищей. Такие аминокислоты называются незаменимыми (10 аминокислот). К ним относятся
лизин, валин, лейцин, изолейцин, треонин, фенилаланин, триптофан, метионин; аргинин и гистидин.
Для человека абсолютно незаменимыми являются лизин, фенилаланин, триптофан.
В растворе аминокислоты могут выступать в роли как кислот, так и оснований, т. е. они являются амфотерными соединениями (NH2 –CH(R) –COOH)
В нейтральной среде аминокислоты существуют в виде биполярных ионов - цвиттер-ионов т.е.
не NH2 – R – COOH , а NH3+ – R - COO –

атом в -положении NH2 –C*H(R) -COOH
Все природные аминокислоты в

белках представлены левовращающим L-стереоизомером.

тринуклеотидных фрагментов – кодонов. При этом из 4 гетероциклических оснований

может быть составлено 64 сочетания для 20 аминокислот, т.е. код является вырожденным (одной аминокислоте соответствует несколько кодонов).

– один кодон.
Наиболее распространенной в природе аминокислотой является
1.

лейцин - среднее содержание в биологическом мире 9,5%,
2. аланин – 7,6%,
3. серин - 7,1%.
Наиболее редкая аминокислота – триптофан 1,2 %

группой другой аминокислоты.
Образующаяся при этом молекула представляет собой дипептид,

а связь -CO-NH- называется пептидной связью:
На одном конце молекулы дипептида находится свободная аминогруппа, а на другом — свободная карбоксильная группа. Благодаря этому дипептид может присоединять к себе другие аминокислоты, образуя олигопептиды. Если таким образом соединяется много аминокислот (более десяти), то получается полипептид.
Пептиды играют важную роль в организме. Многие олиго- и полипептиды являются гормонами, антибиотиками, токсинами.

боли) и некоторые опиаты («естественные наркотики» человека), выполняющие функцию обезболивания.

К олигопептидам относятся и некоторые антибиотики (например, грамицидин S).
Многие гормоны (инсулин, адренокортикотропный гормон и др.), антибиотики (например, грамицидин А), токсины (например, дифтерийный токсин) являются полипептидами.

аминокислоты связаны ковалентной амидной (пептидной) связью.
Белки представляют собой полипептиды,

в молекулу которых входит от пятидесяти до нескольких тысяч аминокислот с относительной молекулярной массой свыше 10 000.
Вторичная структура – укладка полипептидных цепей в регулярные элементы типа -спиралей и -листов (-складчатая структура), стабилизированных водородными связями. Помимо регулярных вторичных структур типа -спиралей и -листов белки содержат нерегулярные элементы, такие как петли, связывающие -спирали и -листы.
Полная классификация белков по вторичной структуре представлена в базах данных Dai/FSSP, CATH, SCOP).

Важными особенностями первичной структуры являются консервативные мотивы : сочетания аминокислот, важных

для функции белка. Консервативные мотивы сохраняются в процессе эволюции видов, по ним можно предсказать функцию неизвестного белка.

аденилаткиназа (фермент) и глютаминсинтетаза (фермент)
14-12 нм
Размеры белков имеют нанометровый

диапазон!!!

том, что последовательность аминокислот
полипептидной цепи (первичная структура) определяет все

последующие структуры в иерархии, включая структуру активного
центра фермента, а также возможность образования компактной функционально значимой структуры и комплексов с другими
белковыми молекулами или биологической мембраной.
Первичная структура стабилизирована ковалентными пептидными
(амидными) связями.

В настоящее время в Интернете находятся несколько баз данных
и программ.
Поиск гомологичных белков, обладающих близкой первичной
структурой (программа BLAST).
2. База данных SWISS-PROT.
3. База данных HSSP (http:www.san.der.embl-heidelberg.de/hsspl)

водородными связями. Водородные связи образуется между атомом кислорода и одной

и атомом азота другой аминокислоты, отстоящей от первой на четыре (3,6) аминокислотных остатка. На один виток спирали приходится 3,6 аминокислотных остатков
-NH-CH(R)-C(O)- NH-CH(R)-C(O)- NH-CH(R)-C(O)- NH-CH(R)-C(O)-NH
1 2 3 4
Для L-аминокислот правосторонняя - спираль устойчивей левосторонней.
Структура белковой молекулы может быть стабилизирована и дисульфидными связями (-S-S-)
(ДНК спираль правозакрученная, по часовой стрелке)

и гидрофобными взаимодействиями

4 аминокислотных остатка, спираль стабилизирована водородными связями между H и

O пептидных групп, отстоящих друг от друга на 4 звена. Спираль построена исключительно из одного типа стереоизомеров аминокислот (L), хотя она может быть как левозакрученной, так и правозакрученной, в белках преобладает правозакрученная. Спираль нарушают электростатические взаимодействия глутаминовой кислоты, лизина, аргинина, близкорасположенные аспарагин, серин, треонин и лейцин могут стерически мешать образованию спирали, пролин вызывает изгиб цепи и также нарушает α-спирали
Термин «α-спираль» был введен Л. Полингом (1951 г.), открывшим укладку пептидной цепи в виде правосторонней спирали в белке α-кератине.

связи образуются между относительно удалёнными друг от друга в первичной

структуре аминокислотами или разными цепями белка, а не близко расположенными, как имеет место в α-спирали. Эти цепи обычно направлены N-концами в противоположные стороны (антипараллельная ориентация).
Для образования β-листов важны небольшие размеры R-групп (радикалов) аминокислот, преобладают обычно глицин и аланин.

его полипептидной цепи в пространстве, способ компактизации белковой молекулы. Процесс

укладки белковой молекулы называется фолдингом. В фолдинге могут принимать участие белки-шапероны. Шапероны – многокомпонентная система, обеспечивающая правильное сворачивание (фолдинг) полипетидной цепи в белке. Третичная структура стабилизирована ионными, водородными и гидрофобными связями, а также ковалентными дисульфидными связями.
Многие белки образуют комплексы между субъединицами, образуя четвертичную структуру. В образовании комплексов большую роль играют электростатические (кулоновские) взаимодействия противоположно заряженных части (ионные взаимодействия), водородные связи, гидрофобные взаимодействия.

- и 2 идентичные -субъединицы), аллостерически регулируемые ферменты, цитохромы Р450

2В4 (гексамер).
Приставка «алло» означает другой. Низкомолекулярные соединения, связываемые белком (часто это не субстраты), называют лигандами. Лиганды, связывающиеся с аллостерическими участками, называются аллостерическими регуляторами или эффекторами. Связывание эффектора отражается на сродстве к субстрату.

пептидные связи (первичная структура).
2. Электростатические взаимодействия (вторичная, третичная и

четвертичная структура).
3. Водородные связи (вторичная, третичная и четвертичная структура).
4. Гидрофобные взаимодействия (третичная и четвертичная структура).

основных класса:
Простые белки дают при гидролизе только аминокислоты. Они содержат

50% C, 7% H, 23% O, 16% N, 0-3% S.
Сложные белки при гидролизе дают кроме аминокислот и другие продукты. Небелковую часть молекулы сложных белков называют простетической группой.

РАЗНООБРАЗИЯ
БЕЛКОВ ДЛЯ МЕДИКО-БИОЛОГОВ
А.С. Иванов

(AFM)
Масс-спектрометрия (MS)
Поверхностный плазмонный резонанс (SPR)
Спектроскопия, флуоресценция, поляризационная флуоресценция
Биоинформационные методы (молекулярная

динамика)
Электрохимия
(методы, используемые в ИБМХ)

функциональных групп активных центров, а также для «сшивания» с различными

носителями, для получения конъюгатов белков, получения биочипов и биосенсоров, для проведения инструментальных исследований и т.п.

цистеина, имидазольная группа гистидина, фенольная группа тирозина, гуанидиновая группа аргинина

могут присоединять протон (ион водорода Н+) и менять знак заряда молекулы белка.
-COO- + Н+ = -COOH
-SH = -S- + Н+

-аминогруппа лизина).
Реакции с альдегидами, с динитрофторбензолом, с ангидридами кислот.
3.

Карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот, Карбоксильная группа С-концевой аминокислоы.
Реакция этерификации, амидирования

кольце.
5. Имидазольная группа гистидина.
Алкилирование, фотоокисление
6. Гуанидиновая группа аргинина.
Реакция

с дионами (бутадион)
7. Сульфгидрильные группы.
Алкилирование, реакция с реактивом Эллмана (5,5,’ –дитио-бис-(2-нитробензойная кислота)

галактоза, манноза,

Фосфопротеиды
Казеин (белок молока)
фосфатная группа, связанная сложноэфирной связью с серином

(FMN, FAD)
Сукцинатдегидрогеназа
Оксидаза D-аминокислот
редуктазы

присутствии специальных веществ - катализаторов. Катализаторы участвуют в реакции, но

в результате ее не расходуются. Катализаторы биологических процессов, протекающих в живых организмах, представляют собой белковые молекулы, которые называют ферментами, или энзимами.

то процесс называется гомогенным, в разных фазах – гетерогенным.
Растворы

низкомолекулярных субстратов –это истинные растворы с размерами частиц менее 1 нм
Растворы ферментов являются коллоидными растворами с размером частиц 1-100 нм

чем в ферментативных реакциях. Однако, ферментативные реакции протекают в 1011-13

раз быстрее некаталитических. Это связано
1) с эффектом сближения (он наблюдается и в неферментативных реакциях), который приводит к селективному увеличению локальной концентрации реагентов,
2) с эффектом ориентации, так как связывание субстратов на поверхности фермента осуществляется таким образом, что они принимают ориентацию, оптимальную для облегчения взаимодействия,
3) с эффектом напряжения, он отражает возможность прикрепления субстрата к ферменту в двух или нескольких местах. В результате такого связывания разрушаемая связь ослабляется благодаря поляризации электронных оболочек и изменению углов связей, энергия активации, требующаяся для разрушения этой связи, понижается.

по реакционной способности 10 М раствору кислоты.

106
Пероксид без катализатора 25 10 -8
водорода
Пероксид HBr 25 10 -4
водорода
Пероксид каталаза 25 10 7
водорода

Роль ферментов как

эффективных катализаторов иллюстрируется на примере разложения пероксида водорода до воды и кислорода. Эта реакция в водном растворе протекает очень медленно, но ее скорость увеличивается в присутствии различных катализаторов.

с -1), деленная на концентрацию активных центров фермента (М). Ее

единицей является с -1
Концентрация активных центров используется вместо концентрации фермента для удобства сравнения с ферментами, имеющими более одного активного центра (например, каталаза имеет 4 активных центра).

мкмоль субстрата в минуту.
Комиссия по номенклатуре и биологии связала МЕ

с системой СИ:
1 катал (кат) – это активность фермента, превращающего 1 моль субстрата в секунду.
1 МЕ = 0,000 000 016 667 кат
1 кат = 60 000 000 МЕ

H2O2 9 ×106
Ацетилхолинэстераза ацетилхолин 1.2 ×104

(ферменты),
2) белки –ингибиторы ферментов,
3) белки-регуляторы активности генома,
4) защитные белки,

белки иммунной и свертывающей системы,
5) токсические белки,
6) транспортные белки

белки,
9) рецепторные белки,
10) белки-гормоны,
11) белки – оболочки вирусов

EC – от англ. Enzyme Commision) состоит из четырех чисел,

разделенных точками (например, КФ 3.2.1.4.) Первая цифра указывает на принадлежность к одному из шести основных классов. Следующие два числа обозначают подклассы и подподклассы ферментов. А последнее число – это серийный номер данного фермента в его подклассе.
Enzyme nomenclature (1976) Biochem. Biophys/Acta, 429, 1-45.
Номенклатура ферментов, М., 1979.

2. Трансферазы. Катализируют реакции переноса групп от одного соединения к

другому.
Пример: аминотрансфераза

трипсин, химотрипсин, ацетил-СоА-гидролаза

Класс 4. Лиазы. Катализируют присоединение групп к двойным

связям или отщепление групп с образованием двойной связи.
Пример: карбоангидраза, изоцитратлиаза.
Класс 5. Изомеразы. Катализируют геометрические или другие изменения в пределах одной молекулы.
Пример: триозофосфатизомераза, аланинрацемаза.

сопряженные с гидролизом пирофосфатной связи в молекуле АТФ.
Пример: тирозил-т-РНК-синтетаза,

ацетат-СоА-лигаза.

enzymes catalysing the translocation of hydrons (hydron being the general

name for H+ in its natural abundance), EC 7.2 contains those catalysing the translocation of inorganic cations and their chelates, EC 7.3 contains those catalysing the translocation of inorganic anions, EC 7.4 contains those catalysing the translocation of amino acids and peptides, EC 7.5 contains those catalysing the translocation of carbohydrates and their derivatives EC 7.6 contains those catalysing the translocation of other compounds.
The sub-subclasses concern the reaction that provided the driving force for the translocation, where these are relevant: EC 7.x.1 translocations linked to oxidoreductase reactions EC 7.x.2 translocations linked to the hydrolysis of a nucleoside triphosphate EC 7.x.3 translocations linked to the hydrolysis of a diphosphate EC 7.x.4 translocations linked to a decarboxylation reaction

для защиты организма от чужеродных белков или соединений. Для образования

антитела на любое требуемое соединение ( гаптен) это соединение должно ковалентно присоединиться к белку. Если гаптеном будет аналог переходного состояния какого-нибудь фермента, можно получить антитела с каталитической активностью.

состоянием является тетраэдр. Эго можно смоделировать соединениями на основе фосфора

(фосфонаты).
Фосфонаты – это фосфорорганические соединения, содержащие связь Р-С (фосфор –углерод).
Стабильные фосфонаты, присоединенные к белку для формирования антигенов, образуют каталитические антитела, обладающие по отношению к эфирам как субстратам каталитической активностью, сравнимой с активностью белкового фермента химотрипсина. Одна из задач этих исследований – образование новых, не обнаруженных в природе ферментов (Schultz and Lerner, 1995)

и РНК, причем РНК также участвует в катализе. Примером может

служить рибосома. Сложный ансамбль многих белков и трех типов РНК. Рибосомы играют ключевую роль в трансляции матричной РНК в белке.
РНК-содержащие ферменты - рибозимы – были примитивными ферментами, которые в настоящее время заменили более эффективные белковые катализаторы. Каталитическая единица РНК Tetrahymena является частью молекулы, которая удаляется в ходе процессинга, обычно она сама вырезается из пре-рибосомной РНК. Освободившись, она может действовать как РНК содержащий фермент. Рибозим Tetrahymena обладает активностью рибонуклеазы (гидролизует РНК) и РНК-лигазы (соединяет или лигирует РНК) (Herschlag and Cech, 1990)

для ряда важнейших процессов, происходящих в клетках живых организмов. В

соответствии с принятой с настоящий момент точкой зрения, для того, что белки смогли выполнить возложенные на них функции, им необходимо принять соответствующую трёхмерную структуру.

Р450 (гемопротеин)
НАДН-зависимая редуктаза (флавопротеин)
цитохром в5 (гемопротеин).
Цитохромы Р450

участвуют в метаболизме лекарственных препаратов, чужеродных соединений, попадающих в организм; в синтезе гормонов, простагландинов.
Для функционирования этой системы необходимо образование продуктивного тройного комплекса этих белков

КЛЕТКИ.
БЕЛОК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ.

А. А. ТЕРЕНТЬЕВ, Н. Т. МОЛДОГАЗИЕВА, К. В. ШАЙТАН

у многоклеточных организмов. Сложность этих взаимодействий часто графически представляют в виде карт

(сетей), где каждая точка соответствует одному белку, а каждая линия — межбелковому взаимодействию

структуры белков, а также химические и генетические модификации белков
Рентгеноструктурный

анализ
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса.
Атомная силовая микроскопия
Масс-спектрометрия
Поверхностный плазмонный резонанс
Спектроскопия, флуоресценция
Биоинформационные методы
Молекулярная динамика
(методы, используемые в ИБМХ)

(белок-белковых взаимодействий), обусловлено тем, что белковая интерактомика находится на стыке

различных научных дисциплин, таких, как биохимия, геномика, биоинформатика, компьютерное молекулярное моделирование, клеточная биология, молекулярная биология, биофизика и др. Условно все подходы в интерактомике можно разделить на две группы: биоинформационные и экспериментальные. В свою очередь каждая из этих групп включает в себя много разнообразных подходов в исследовании ББВ.
Белки не присутствуют в клетке сами по себе. Они друг с другом взаимодействуют. В частности, молекулы белков актина, миозина и др. образуют мышечные волокна. Другой пример — каскады передачи сигналов.

ИЗ ЛИСТЬЕВ Beta vulgaris, образуемых тремя ферментами фазы карбоксилирования цикла Кальвина -

Бенсона:
рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазой (РБФК/О),
рибозофосфатизомеразой (РФИ) и
фосфорибулокиназой (ФРК), в строме хлоропластов
Цитохромы Р450, редуктаза, цитохром в5

«инфекция». Все известные прионные заболевания млекопитающих вызываются белком PrP
Все известные

прионы вызывают формирование амилоидов — белковых агрегатов, включающих плотно упакованные β-слои.
Превращение нормального белка в патогенный происходит путем белок-белковых взаимодействий

белка приона РrР и выявлен ген Prnp, начались интенсивные поиски

причин патогенности прионов.
С помощью современных методов молекулярно-генетического анализа были получены новые данные о возможных вариантах состава и конформации (укладки) полипептидной цепи РrР.
Было установлено, что конверсия нормального прионного белка в его инфекционную изоформу - посттрансляционный процесс . Анализ вторичной структуры РrРSc показал, что этот переход характеризуется большими структурными изменениями самого приона. Клеточный белок содержит 42% a-спиралей и почти не содержит β-тяжей (всего около 3%), в то время как в его инфекционной форме выявляется 30% a-спиралей и 43% β -тяжей.

НИИ Биомедхимии, М. 2000.
Т. Келети, Основы ферментативной кинетики, М.

Мир, 1990.
В. Уильямс, Х. Уильямс, Физическая химия для биологов. М. Мир, 1976.
Э. Фершт, Структура и механизм действия ферментов. М.Мир, 1980.
А.А. Клесов, И.В. Березин, Ферментативный катализ. МГУ, 1980.
И.В. Березин, А.А. Клесов, Практический курс химической и ферментативной кинетики, МГУ, 1976.
Е. В. Петушкова, Введение в кинетику ферментативных реакций. МГУ, 1972.
И.В. Березин, К. Мартинек, Основы физической химии ферментативного катализа. М. Высшая школа, 1977.
Э. Корниш-Бодуен, Основы ферментативной кинетики, М.Мир, 1979.
М. Диксон, Э. Уэбб. Ферменты. М., ИИЛ, 1961.
В. Дженкс, Катализ в химии и энзимологии, М. Мир, 1972.
В.К. Плакунов. Основы энзимологии. М. Логос, 2002.
С.Д. Варфоломеев. Химическая энзимология, М, Academia, 2005
С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. Биокинетика: Практический курс. - М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999.
И.Тиноко, К.Зауэр, Дж. Вэнг, Дж. Паглиси. Физическая химия. Принципы и применение в биологических науках. Техносфера. Москва. 2005.
Х. Биссвангер. Практическая энзимология. М., БИНОМ. Лаборатория знаний. 2010.
Т.П. Вавилова, А.Е. Медведев, Биологическая химия. Биохимия полости рта. М., «ГЕОТАР_Медиа», 2014 г.