Методы количественного определения антибиотиков

Автор Т.С. Шостак

Соавтор А.Н. Сизенцов

анализов, зависимость точности результатов от многих внешних факторов и т.

п.

Точность биологических методов обычно составляет ± 10 %

Они основаны на непосредственном биологическом действии антибиотика на используемый тест-организм, чувствительный к данному препарату, а поэтому считаются наиболее объективными

Биологические методы количественного определения антибиотиков

количественного определения антибиотиков получили

метод последовательных разведений,

диффузионный

турбидиметрический метод.

в культуральных жидкостях, растворах или экстрактах. Для работы подготавливают питательный

бульон, пригодный для развития выбранного тест-организма.

Непременное условие – бульон должен быть прозрачным

Стерильный питательный бульон разливают в чистые стерильные пробирки; количество бульона должно обеспечивать нужную степень разведения изучаемого антибиотика.

не только в условных единицах разведения, но и в весовых

или стандартных единицах. Для этой цели титрование (разведение) должно проводиться стандартным раствором данного антибиотика, имеющего известную активность, выраженную в мкг/мг или в ед/мг препарата.

Разведение испытуемой жидкости и разведение стандартного раствора антибиотика необходимо проводить в бульоне с фосфатным буфером при рН 7,8-8,0.
Пример расчета приведен в таблице 1

тест-культуры в наибольшем разведении, соответствующем 5-й пробирке. Следовательно, 5 мкг/мл

вызвали бы подавление роста микроба только в 4-й пробирке, но не в 5-й, а 20 мкг/мл задержат рост в 6-й пробирке, 40 мкг/мл – в 7-й; 80 мкг/мл – в 8-й; 160 мкг/мл – в 9-й; 320 мкг/мл – в 10-й пробирке и т.д. Сравнивая эти величины, устанавливают, что испытуемый раствор, задерживающий развитие тест-организма в 10-й пробирке (разведение 1:1024), содержит 320 мкг/мл стрептомицина.

где Ри – максимальная степень разведения испытуемого раствора, прикоторой отсутствует рост тест-организма;
Рс – максимальная степень разведения стандартного раствора, обеспечивающая отсутствие роста тест-микроба;
С – исходная концентрация стандартного раствора антибиотика;
Х– искомая концентрация антибиотика в исследуемом растворе.

В нашем примере Ри=1024, Рс=32, С=10 мкг/мл; искомая концентрации антибиотика :
X = 1024 : 32 × 10 = 320 мкг/мл.

Расчет антибиотической активности испытуемого раствора при работе по методу последовательных разведений при наличии стандарта можно производить по следующей формуле:
Х = Ри / Рс × С

сопоставимые результаты лишь при соблюдении определенных условий, а именно:

4)

определенная длительность инкубации пробирок, засеянных тест-культурой

3) внесение определенного количества клеток или спор тест-Организм

2) использование постоянных сред для разведения одного итого же антибиотика

чашках Петри. В пробирки, содержащие по 9 мл расплавленного питательного

агара, вносят по 1 мл определенного разведения изучаемого антибиотика или культуральной жидкости. После тщательного перемешивания содержимое пробирки выливают в чашку Петри и дают агару застыть. Затем по поверхности пластинки штрихами производят посев тест-организмов. Чашки выдерживают в термостате при оптимальной для используемых тест-организмов температуре в течение 20-21ч.

Преимущество этого метода по сравнению с пробирочным методом разведений состоит в том, что в данном случае каждое разведение изучаемого препарата может быть использовано для многих тест-организмов.

веществ диффундировать в агаровых средах и образовывать зоны, в которых

не развиваются используемые тест-организмы.

Величина зоны диффузии антибиотика зависит, прежде всего, от химической природы антибиотического вещества и его концентрации, состава агаровой среды, ее рН, температуры и других факторов, которые необходимо учитывать при проведении анализа.

Антибиотики-полипептиды, обладающие большой и сложной молекулой, диффундируют гораздо медленнее, чем, например, антибиотики ациклического строения или антибиотики тетрациклиновой природы и гетероциклического строения. Поэтому для количественного определения антибиотиков, трудно диффундирующих в агаризованных средах, необходимо подбирать условия, обеспечивающие лучшую их диффузию. К таким условиям можно отнести добавление к среде отдельных веществ, повышающих диффузию антибиотиков.

диффузии антибиотика при нормальном периоде роста тест-организма. Концентрации испытуемых антибиотиков

не должны быть слишком высокими, так как установлено, что диаметр зоны задержки роста тест-организма есть линейная функция логарифмов концентрации антибиотика, но лишь в определенных пределах концентрации. Так, увеличение концентрации неомицина выше 5 % по существу не сказывается на величине зоны задержки роста тест-микроба. Величина зоны задержки роста тест-организма зависит в определенной степени от длительности контакта антибиотика со средой (таблица 2)

от времени контакта антибиотика (на бумажном диске с агаром) (по

Teillon, 1953)

Анализы необходимо проводить через определенный интервал времени, так как между моментом посева тест-организма и началом его прорастания проходит какой-то промежуток времени, в течение которого антибиотик продолжает диффундировать в агар и оказывать биологическое действие

Состав агаровой среды и ее рН также существенно влияют на величину образования зон задержки и рост тест-микроба.
Величина зоны задержки роста тест-организма зависит в определенной степени от длительности контакта антибиотика со средой (таблица 2).

моментом посева тест-организма и началом его прорастания проходит какой-то промежуток

времени, в течение которого антибиотик продолжает диффундировать в агар и оказывать биологическое действие.
Состав агаровой среды и ее рН также существенно влияют на величину образования зон задержки и рост тест-микроба.
Стрептомицин, стрептотрицин, неомицин проявляют антибиотические свойства более сильно в щелочной среде (рН 7,5-8,0), тетрациклиновые антибиотики наиболее активны в слабо-кислой зоне (рН среды 6,3-6,4)

Применение в опытах постоянной плотности вегетативных микробных клеток и спор тест-организма в агаровой среде дает возможность получать зоны угнетения роста используемой тест-культуры соответствующей величины с резко очерченными краями.
Разработаны соответствующие поправки, которые необходимо вносить при использовании взвеси спор тест-организмов в процессе определения биологической активности антибиотиков. Поправки по отношению к числовому эквиваленту мутности для взвесей тифозных бактерий следующие:
-Споры L2 (типа B.subtilis) .......................1/12
-Споры В.mycoides ....................................1/6
-Споры В.mycoides (гладкий вариант) .….1/5

Зная эти поправки, можно рассчитать число спор в 1 мл суспензии.

использованием металлических цилиндриков

пластинки делают лунки диаметром 8 мм. используя пробочное сверло соответствующего

диаметра или специально сделанное приспособление, состоящее из резиновой груши, в которую вставляют заостренную с одного конца металлическую трубочку с внешним диаметром 8 мм. Блочки, надрезанные пробочным сверлом на всю глубину агаровой пластинки, удаляют с помощью стерильного скальпеля или специального крючка. В одни лунки вносят раствор испытуемого антибиотика, а в другие – стандартный раствор антибиотика (рисунок 4).

Рисунок 4 – Определение антибиотической активности препаратов в кюветах с использованием лунок в толще агара

Метод лунок имеет некоторые преимущества по сравнению с первым методом (нет необходимости в очистке и стерилизации цилиндриков).

тест-организмом, помещают диски фильтровальной бумаги, пропитанные испытуемым раствором антибиотика. В

качестве стандарта используют диски, смоченные раствором антибиотика известной концентрации, или специально приготовленные диски, содержащие уже известное количество антибиотиков. Дальнейшие операции проводят так же, как и при работе с применением лунок в толще агара. В некоторых случаях при использовании бумажных дисков получаются зоны неправильной формы. Это связано с тем, что в данном случае диск фильтровальной бумаги оказывается хроматограммой изучаемого антибиотика и препарат концентрируется в одном участке диска.

определенную оптическую плотность среды (мутность) в результате роста в присутствии

небольших количеств антибиотика. В присутствии небольших количеств антибиотика не происходит полного подавления роста тест-микроба, а лишь задержка темпа их роста, что и сказывается на оптической плотности бульона.

Турбидиметрические методы определения антибиотиков обычно неприемлемы для плотно окрашенных растворов

Эти методы пригодны для количественного определения любых антибиотиков при условии наличия стандартного раствора изучаемого препарата. При подборе быстрорастущих организмов, используемых в качестве тест-объектов, турбидиметрический метод можно использовать как экспресс метод – ответ получают через 3,5-4 ч.