Пыльцевая трубка

Содержание

1. Пыльцевая трубка
2. Скорость роста – до 1 см/час!Длина –
3. 18241847Ассирийские священники и египетские боги изображались в
4. Что представляет собой пыльца? Мужской гаметофит –
5. Жизнь пыльцы
6. Пыльцевая трубка как модельный объектГаплоидный геном –
7. Ключевые механизмы поддержания полярного роста:Зональная организация цитоплазмы
8. Везикулярный транспорт и движение органелл по цитоскелету:
9. Апикальный (или «растущий») компартментБазальный компартментАпикальный рост пыльцевой
10. Функции циклоза1. Транспорт мужского гаметного модуля (MGU).2.
11. Растущий компартментLancelle, Hepler, 1992Брейгина и др., 2009
12. Цитоскелет
13. Актиновый цитоскелет играет ключевую роль в поддержании
14. МикротрубочкиОтвечает за транспорт спермиев к зародышевому мешкуОстальные
15. Рециклирование мембран необходимо для поддержания полярности –
16. Поляризованная секреция поддерживается благодаря актиновому цитоскелету, а
17. Клеточная стенка: градиент жесткостиДвижущей силой для
18. Этерифицированные пектины откладываются в кончике трубки в
19. КаллозаBreygina et al., 2012Xie et al., 2012Отсутствует
20. Жесткий компонент, но его не очень многоОтложение
21. Регуляторные механизмы: кальцийHepler, 2012Кальций входит в кончике
22. Кальциевый градиент определяет место слияния везикул с
23. В кончике рН кислый, протоны входят в
24. контрольортованадатфузикокцинБрейгина и др., 2010Градиент мембранного потенциалаконтрольортованадатNPPBБрейгина и др., 2010
25. Таким образом, пыльцевая трубка – прекрасная модель
26. Регуляторные механизмы: ГТФазыQin, Yang, 2011GFP-NtRab2Маленькие ГТФ-связывающие белки
27. Фосфатидилинозитолдифосфат (PIP2) есть только в апикальной мембране
28. ОсцилляцииChebli, Geitmann, 2007
29. АФК как сигнал от «принимающей стороны»АФК накапливаются
30. Экссудат рыльца и экзогенный Н2О2 вызывают гиперполяризацию
31. АФК как сигнал: H2O2 активирует Ca2+ ток
32. АФК как сигнал: H2O2 активирует ток K+Сравнение
33. АФК как сигнал: H2O2 убирает в трубках
34. Два оптических метода оценки EmРатиометрический быстрый краситель
35. Количественная флуоресцентная микроскопия: динамика эффекта Проточная цитометрия
36. Гиперполяризация плазмалеммы при действии H2O2 (10 μМ)
37. АФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризацию Количественная
38. Ca2+K+АДФ + ФнАТФH+Cl-H2O2++??Em
39. В трубке ион-транспортные системы расположены полярно Они
40. Пероксид водорода вызывает изменения протеома пыльцы. Появляются
41. Цветковые VS ХвойныеИзученный модельный объектБыстрый ростУниполярный ростОбращенный
42. Градиент мембранного потенциалатабакель
43. Биполярное прорастание у елиBreygina et al., 2019 (в соавторстве с Полевовой С.В.)
44. Две трубки, а МГМ один. Куда же
45. Биполярное прорастание: динамика2 часа6 часов9 часовСколько разрывов – столько и трубокBreygina et al., 2019
46. Биполярное прорастание характерно для мешковой пыльцыМы описали
47. Никита Максимов, сотрудникСаша Подолян, студент магистратурыГруппа репродуктивной физиологии растений МГУГруппа в контакте: http://vk.com/club83308044Катя Клименко, сотрудник
48. Спасибо за внимание!Работы выполнены при поддержке РФФИ
49. Скачать презентанцию

Скорость роста – до 1 см/час!Длина – до десятков сантиметров!Безошибочная «адресная» доставка спермиев через ткани пестикаХранение без потери способности к прорастанию в течение десятков лет!И все эти возможности заключены в зернышке

Слайды и текст этой презентации

Слайд 1Пыльцевая трубка
Основные механизмы полярного роста

Слайд 2Скорость роста – до 1 см/час!
Длина – до десятков сантиметров!
Безошибочная

«адресная» доставка спермиев через ткани пестика
Хранение без потери способности к

прорастанию в течение десятков лет!
И все эти возможности заключены в зернышке диаметром около 0,03 мм!

Огромные возможности маленького организма

Скорость роста – до 1 см/час!Длина – до десятков сантиметров!Безошибочная «адресная» доставка спермиев через ткани пестикаХранение без

Слайд 31824
1847
Ассирийские священники и египетские боги изображались в процессе ритуального опыления

пальмы (5000 лет до н.э.).
Уже тогда было известно, что

для гарантированного получения семян требуется переносить пыльцу на рыльце
Однако точное установление роли пыльцевой трубки в доставке «мужской компоненты» - только в середине XIX века

Пыльца с нами тысячи лет

18241847Ассирийские священники и египетские боги изображались в процессе ритуального опыления пальмы (5000 лет до н.э.). Уже тогда

Слайд 4Что представляет собой пыльца? Мужской гаметофит – гаплоидное поколение семенных

растений, у цветковых - организм из 2х или 3х клеток

Что представляет собой пыльца? Мужской гаметофит – гаплоидное поколение семенных растений, у цветковых - организм из 2х

Слайд 5Жизнь пыльцы

Слайд 6Пыльцевая трубка как модельный объект
Гаплоидный геном – легко выявить важные

гены
Отсутствие межклеточных контактов – напрямую реагирует на внешние воздействия
Малый размер

и состояние покоя – удобно хранить и культивировать
Сходство с другими объектами, характеризующимися полярным типом роста
Высокая скорость роста (у цветковых)

Пыльцевая трубка как модельный объектГаплоидный геном – легко выявить важные геныОтсутствие межклеточных контактов – напрямую реагирует на

Слайд 7Ключевые механизмы поддержания полярного роста:
Зональная организация цитоплазмы позволяет каждой органелле

быть «в нужное время в нужном месте»
Неоднородность в строении клеточной

стенки позволяет тургору растягивать клетку направленно
Каллозные пробки и вакуоли позволяют не наращивать объем цитоплазмы бесконечно
На молекулярном уровне: сигнальные сети контролируют процесс через цитоскелет и поляризованную секрецию

Как пыльцевой трубке удается так быстро расти?

Ключевые механизмы поддержания полярного роста:Зональная организация цитоплазмы позволяет каждой органелле быть «в нужное время в нужном месте»Неоднородность

Слайд 8Везикулярный транспорт и движение органелл по цитоскелету: доставка стройматериалов и

энергообеспечение
Клеточная стенка – механическая составляющая
Ионные градиенты и мембранный потенциал
ГТФазы и

другие компоненты сигнальных каскадов (активно изучаются)
АФК (малоизучено)

Основные игроки

Везикулярный транспорт и движение органелл по цитоскелету: доставка стройматериалов и энергообеспечениеКлеточная стенка – механическая составляющаяИонные градиенты и

Слайд 9Апикальный (или «растущий») компартмент
Базальный компартмент
Апикальный рост пыльцевой трубки поддерживается за

счет полярной организации цитоплазмы. Она разделена на функциональные компартменты:
Полярность структуры

Апикальный (или «растущий») компартментБазальный компартментАпикальный рост пыльцевой трубки поддерживается за счет полярной организации цитоплазмы. Она разделена на

Слайд 10Функции циклоза
1. Транспорт мужского гаметного модуля (MGU).
2. Транспорт в апекс

сигнальных молекул и ферментов для взаимодействия с пестиком.
3. Строительные материалы,

включая фосфолипиды, полисахариды, стеночные ферменты.
4. В апексе везикулы доставляются в определенные зоны поверхности, где происходит их экзоцитоз.
5. Эндоцитоз обеспечивает приток в трубку из пестика питательных веществ и сигнальных молекул, поддерживает «уникальность апекса» и правильное соотношение между материалами для строительства стенки и плазмалеммы.

Функции циклоза1. Транспорт мужского гаметного модуля (MGU).2. Транспорт в апекс сигнальных молекул и ферментов для взаимодействия с

Слайд 11Растущий компартмент
Lancelle, Hepler, 1992
Брейгина и др., 2009

Слайд 12Цитоскелет

Слайд 13Актиновый цитоскелет играет ключевую роль в поддержании полярного роста
Продольные актиновые

тяжи обеспечивают ток цитоплазмы (фонтан)
Кольцевая структура в субапикальной зоне задает

направление роста. Скорее всего, путем регуляции везикулярного транспорта
Виллин стабилизирует филаменты актина там, где концентрация кальция низкая
Профилин не дает тяжам сформироваться в апикальной зоне, где концентрация кальция на порядок выше.
Кофилин и Actin depolymerizing factor (ADF) регулируются рН, их активность определяется рН профилем

Микрофиламенты

Cheung et al., 2008

Lovy-Wheeler et al., 2005

Актиновый цитоскелет играет ключевую роль в поддержании полярного ростаПродольные актиновые тяжи обеспечивают ток цитоплазмы (фонтан)Кольцевая структура в

Слайд 14Микротрубочки
Отвечает за транспорт спермиев к зародышевому мешку
Остальные функции неизвестны
Ингибиторы не

останавливают рост ПТ
Кинезин идентифицирован
Часто располагается вместе с МФ, а также

образует комплексы с ПМ и ЭПР

Lancelle et al., 1987

Laitiainen et al., 2002

МикротрубочкиОтвечает за транспорт спермиев к зародышевому мешкуОстальные функции неизвестныИнгибиторы не останавливают рост ПТКинезин идентифицированЧасто располагается вместе с

Слайд 15Рециклирование мембран необходимо для поддержания полярности – «уникальность апекса».
В пыльцевой

трубке образование окаймленных пузырьков с клатриновой шубой происходит в субапикальной

области
Дальнейшее движение везикул происходит по актиновым филаментам «ошейника»
Контроль за эндоцитозом осуществляет фосфатидил-инозитольная сигнальная система.

Эндоцитоз

Bove et al., 2008

Рециклирование мембран необходимо для поддержания полярности – «уникальность апекса».В пыльцевой трубке образование окаймленных пузырьков с клатриновой шубой

Слайд 16Поляризованная секреция поддерживается благодаря актиновому цитоскелету, а также аннексину и

белкам экзоцистного комплекса
Экзоцисты предсталяют из себя октомерный комплекс из белков,

отвечающих за движение пузырька вдоль цитоскелета, а также определяющих место его слияния с ПМ.
Аннексины отвечают за слияние мембран. Их активность зависит от концентрации кальция
Большинство ученых считают, что экзоцитоз происходит в самом кончике, однако есть и другая гипотеза.

Экзоцитоз

Breygina et al., 2012

Kroh, Knuiman, 1985

Поляризованная секреция поддерживается благодаря актиновому цитоскелету, а также аннексину и белкам экзоцистного комплексаЭкзоцисты предсталяют из себя октомерный

Слайд 17Клеточная стенка: градиент жесткости
Движущей силой для роста является тургорное давление.

Однако, оно не является векторной силой. За счет чего же

рост становится направленным?
Механический градиент жесткости
Какие компоненты ответственны за него?

Chebli, Geitmann, 2007

Клеточная стенка: градиент жесткостиДвижущей силой для роста является тургорное давление. Однако, оно не является векторной силой.

Слайд 18Этерифицированные пектины откладываются в кончике трубки в процессе экзоцитоза
По мере

удаления от кончика они деэтерифицируются при участии фермента пектинметилэстеразы (ПМЕ)
Кальций

участвует в образовании сшивок между молекулами пектинов, увеличивая прочность полимерной сети
Это обеспечивает градиент жесткости от кончика к ПЗ

Пектины

Кислые пектины

Метилированные пектины

Li et al., 1994

Parre, Geitmann, 2005

Этерифицированные пектины откладываются в кончике трубки в процессе экзоцитозаПо мере удаления от кончика они деэтерифицируются при участии

Слайд 19Каллоза
Breygina et al., 2012
Xie et al., 2012
Отсутствует в кончике
Появляется на

расстоянии 10-30 мкм
Образует каллозные пробки в длинных трубках
Откладывается в кончике

в ответ на
стрессовое воздействие

КаллозаBreygina et al., 2012Xie et al., 2012Отсутствует в кончикеПоявляется на расстоянии 10-30 мкмОбразует каллозные пробки в длинных

Слайд 20Жесткий компонент, но его не очень много
Отложение также неравномерное: в

кончике отсутствует, далее постепенно накапливается по направлению к ПЗ.
Целлюлоза
Parre, Geitmann,

2005

Жесткий компонент, но его не очень многоОтложение также неравномерное: в кончике отсутствует, далее постепенно накапливается по направлению

Слайд 21Регуляторные механизмы: кальций
Hepler, 2012
Кальций входит в кончике трубки через каналы

, а в субапикальной области входит в органеллы и выкачивается

через ПМ с помощью помпы.
Таким образом, поддерживается крутой градиент его концентрации в апикальной зоне
Кальций – центральный регулятор роста, с нарушением градиента рост прекращается

Michard et al., 2008

Регуляторные механизмы: кальцийHepler, 2012Кальций входит в кончике трубки через каналы , а в субапикальной области входит в

Слайд 22Кальциевый градиент определяет место слияния везикул с ПМ и, таким

образом, задает направление роста
Кальций регулирует динамику актиновых филаментов через Са-чувствительные

актин-связывающие белки (ABPs),
Кальций модулирует активность Са-зависимых протеин-киназ (CDPKs)

Регуляторные механизмы: кальций

Michard et al., 2008

Кальциевый градиент определяет место слияния везикул с ПМ и, таким образом, задает направление ростаКальций регулирует динамику актиновых

Слайд 23В кончике рН кислый, протоны входят в цитоплазму, предположительно, через

неспецифичные катионные каналы. Кислый кончик присутствует только в растущих трубках.
В

субапикальной зоне обнаружен «щелочной поясок», именно в этой зоне работают Н+-АТФазы, выкачивающие протоны. Присутствует даже в нерастущих трубках.

Протонный градиент

Chebli, Geitmann, 2007

Michard et al., 2008

Podolyan et al., 2019

В кончике рН кислый, протоны входят в цитоплазму, предположительно, через неспецифичные катионные каналы. Кислый кончик присутствует только

Слайд 24контроль
ортованадат
фузикокцин
Брейгина и др., 2010
Градиент мембранного потенциала
контроль
ортованадат
NPPB
Брейгина и др., 2010

Слайд 25Таким образом, пыльцевая трубка – прекрасная модель для изучения ИОННОЙ

РЕГУЛЯЦИИ РОСТА, которая включает в себя
Работу ионных каналов и

помп
Их дифференциальную регуляцию
Градиенты концентрации ионов в цитоплазме
Электрическое поле и мембранный потенциал

Ионная регуляция

Michard E. et al. 2009. Int. J. Dev. Biol. 53: 1609-1622; Gutermuth T. et al., 2013. Plant Cell. 25: 4525.

Таким образом, пыльцевая трубка – прекрасная модель для изучения ИОННОЙ РЕГУЛЯЦИИ РОСТА, которая включает в себя Работу

Слайд 26Регуляторные механизмы: ГТФазы
Qin, Yang, 2011
GFP-NtRab2
Маленькие ГТФ-связывающие белки - универсальные переключатели

сигнальных путей.
Rab2 осуществляет контроль секреторного пути между ЭПР и

аппаратом Гольджи в растущей пыльцевой трубке, локализован в аппарате Гольджи.
Rab11b локализован в везикулах и отвечает за терминальный участок секреторного пути: слияние везикул с плазмалеммой
ROP1 локализован в апикальной ПМ и важен для поддержания локального экзоцитоза.

Регуляторные механизмы: ГТФазыQin, Yang, 2011GFP-NtRab2Маленькие ГТФ-связывающие белки - универсальные переключатели сигнальных путей. Rab2 осуществляет контроль секреторного пути

Слайд 27Фосфатидилинозитолдифосфат (PIP2) есть только в апикальной мембране растущих ПТ
Его узкая

локализация обеспечивается белком phosphotidylinositol transfer protein (PITP) и фосфолипазой C

(PLC), которая режет PIP2 с образованием инозитол-3-фосфата (IP3) и диацилглицерола (DAG)
Этот процесс необходим для поддержания ионных градиентов и полярной структуры актиновых тяжей (через регуляцию актин-связывающих белков).

Регуляторные механизмы: фосфолипиды

Helling et al., 2006

Фосфатидилинозитолдифосфат (PIP2) есть только в апикальной мембране растущих ПТЕго узкая локализация обеспечивается белком phosphotidylinositol transfer protein (PITP)

Слайд 28Осцилляции
Chebli, Geitmann, 2007

Слайд 29АФК как сигнал от «принимающей стороны»
АФК накапливаются в тканях рыльца

различных видов при подготовке к опылению.
АФК входят в состав

рыльцевого экссудата табака

1. Рыльце

АФК как сигнал от «принимающей стороны»АФК накапливаются в тканях рыльца различных видов при подготовке к опылению. АФК

Слайд 30Экссудат рыльца и экзогенный Н2О2 вызывают гиперполяризацию мембраны пыльцевых протопластов
Эффект

экссудата снимается каталазой и тушителем MnTMPP
Основное действующее на МП вещество

экссудата - Н2О2

АФК как сигнал от «принимающей стороны»

Данные получены в сотрудничестве с Е.Шиловым

АФК как сигнал от «принимающей стороны»

Экссудат рыльца и экзогенный Н2О2 вызывают гиперполяризацию мембраны пыльцевых протопластовЭффект экссудата снимается каталазой и тушителем MnTMPPОсновное действующее

Слайд 31АФК как сигнал: H2O2 активирует Ca2+ ток и вход Ca2+

в цитоплазму
Breygina et al., 2016. Plant Biol.18: 761-67.
H2O2-индуцированный вход

Ca2+ в цитоплазму (краситель Fluo-3) в протопластах табака и трубках лилии

10 µМ H2O2

10 µМ H2O2+ нифедипин

H2O2-активируемый входящий Ca2+ ток в протопластах лилии

Podolyan et al., 2019

Breygina et al., 2016

Максимов и др., 2015

Слайд 32АФК как сигнал: H2O2 активирует ток K+
Сравнение средней плотности тока

при (в % от контроля).
H2O2 – активирует K+ ток;

TEA – ингибитор K+ каналов, блокирует ток. Все отличия достоверны (p < 0.05 критерий Уилкоксона).

Средние вольт-амперные характеристики выходного K+ тока.

Breygina et al., 2016

АФК как сигнал: H2O2 активирует ток K+Сравнение средней плотности тока при (в % от контроля). H2O2 –

Слайд 33АФК как сигнал: H2O2 убирает в трубках «щелочной поясок»
В

растущих трубках лилии вслед за массированным входом кальция происходит сглаживание

градиента рН, что указывает на ингибирование Н+-АТФазы

контроль

H2O2

Podolyan et al., 2019

Слайд 34Два оптических метода оценки Em
Ратиометрический быстрый краситель Di-4-ANEPPS:
Съемка в двух

каналах при возбуждении синим (Fb) и зелёным (Fg) светом –

нет зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации красителя;
Не выцветает и быстро реагирует на изменения – позволяет регистрировать динамику.

Медленный краситель DiBAC4(3):
позволяет определить абсолютные значения Em (расчет ведется относительно полностью деполяризованных клеток)
Прост в использовании: позволяет работать с большими популяциями клеток, набирая статистические данные.

Два оптических метода оценки EmРатиометрический быстрый краситель Di-4-ANEPPS:Съемка в двух каналах при возбуждении синим (Fb) и зелёным

Слайд 35Количественная флуоресцентная микроскопия: динамика эффекта
Проточная цитометрия с красителем DiBAC4(3):

исследование большой популяции протопластов
АФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризацию
Максимов и

др., 2015. Цитология, 57: 720-26.

контроль

10 µМ H2O2

Данные получены в сотрудничестве с Е.Шиловым

Максимов и др., 2015

Количественная флуоресцентная микроскопия: динамика эффекта Проточная цитометрия с красителем DiBAC4(3): исследование большой популяции протопластовАФК как сигнал: H2O2

Слайд 36Гиперполяризация плазмалеммы при действии H2O2 (10 μМ) - распределение
После 10

минут инкубации происходит достоверное смещение популяции в область более отрицательного

потенциала.

Гиперполяризация плазмалеммы при действии H2O2 (10 μМ) - распределениеПосле 10 минут инкубации происходит достоверное смещение популяции в

Слайд 37АФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризацию
Количественная флуоресцентная микроскопия с красителем

di-4-ANEPPS: интактные растущие трубки лилии
контроль
500 µM
H2O2
Podolyan et al., 2019

АФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризацию Количественная флуоресцентная микроскопия с красителем di-4-ANEPPS: интактные растущие трубки лилииконтроль500 µM

Слайд 38Ca2+
K+
АДФ + Фн
АТФ
H+
Cl-
H2O2
+
+
?
?
Em

Слайд 39В трубке ион-транспортные системы расположены полярно
Они формируют в цитоплазме

динамичные градиенты концентраций, а на мембране – градиент МП
АФК-сигнал, приходя

в трубку, меняет прямо или косвенно работу практически всех ион-транспортных систем
Тем самым АФК вызывают перестройку внутренних градиентов

NOX

H2O2

АФК как сигнал: H2O2 вызывают перестройку всех градиентов

В трубке ион-транспортные системы расположены полярно Они формируют в цитоплазме динамичные градиенты концентраций, а на мембране –

Слайд 40Пероксид водорода вызывает изменения протеома пыльцы. Появляются более 50 белков,

которых не было в контроле.
Основные направления: энергетика, метаболизм, синтез белка
Всё

для активного роста!
Ни одного антиоксиданта!

АФК как сигнал: протеомика

Данные получены в лабораторией протеомики ИБХ РАН

Пероксид водорода вызывает изменения протеома пыльцы. Появляются более 50 белков, которых не было в контроле.Основные направления: энергетика,

Слайд 41Цветковые VS Хвойные
Изученный модельный объект
Быстрый рост
Униполярный рост
Обращенный фонтан
Крутой градиент Са2+
Крутой

градиент МП
Зависимость от межклеточного взаимодействия

Относительно новый объект
Медленный рост
Возможность биполярного роста
Прямой

фонтан
Плавный градиент Са2+
Плавный градиент МП
Больше «автономности»

Цветковые

Хвойные

Слайд 42Градиент мембранного потенциала
табак
ель

Слайд 43Биполярное прорастание у ели
Breygina et al., 2019
(в соавторстве с

Полевовой С.В.)

Слайд 44Две трубки, а МГМ один. Куда же он пойдет?
Он тоже

сомневается…
b
a
c
d
Биполярное прорастание: ядро
Breygina et al., 2019

Слайд 45Биполярное прорастание: динамика
2 часа
6 часов
9 часов
Сколько разрывов – столько и

трубок
Breygina et al., 2019

Слайд 46Биполярное прорастание характерно для мешковой пыльцы
Мы описали феномен и посмотрели,

можно ли на него повлиять
Снова АФК!
Биполярное прорастание: почему?
Breygina et

al., 2019

Биполярное прорастание характерно для мешковой пыльцыМы описали феномен и посмотрели, можно ли на него повлиятьСнова АФК!Биполярное прорастание:

Слайд 47Никита Максимов, сотрудник
Саша Подолян, студент магистратуры
Группа репродуктивной физиологии растений МГУ
Группа

в контакте: http://vk.com/club83308044

Катя Клименко, сотрудник

Никита Максимов, сотрудникСаша Подолян, студент магистратурыГруппа репродуктивной физиологии растений МГУГруппа в контакте: http://vk.com/club83308044Катя Клименко, сотрудник

Слайд 48Спасибо за внимание!

Работы выполнены при поддержке
РФФИ (19-04-00282 рук. М.

Брейгина, 18-34-00979 рук. Н. Максимов)
РНФ 19-74-00036 (рук. М. Брейгина)

Конфокальные

микрофотографии сделаны на ББС МГУ
Пэтч-кламп выполнен в сотрудничестве с кафедрой физиологии человека и животных
Проточная цитометрия выполнена в сотрудничестве с кафедрой иммунологии
Протеомика выполнена в сотрудничестве с лабораторией протеомики ИБХ

Спасибо за внимание!Работы выполнены при поддержке РФФИ (19-04-00282 рук. М. Брейгина, 18-34-00979 рук. Н. Максимов) РНФ 19-74-00036

Скачать презентацию

Разделы презентаций

Пыльцевая трубка

Содержание

Слайды и текст этой презентации

Слайд 1Пыльцевая трубкаОсновные механизмы полярного роста

Слайд 2Скорость роста – до 1 см/час!Длина – до десятков сантиметров!Безошибочная

«адресная» доставка спермиев через ткани пестикаХранение без потери способности к

Слайд 318241847Ассирийские священники и египетские боги изображались в процессе ритуального опыления

пальмы (5000 лет до н.э.). Уже тогда было известно, что

Слайд 4Что представляет собой пыльца? Мужской гаметофит – гаплоидное поколение семенных

растений, у цветковых - организм из 2х или 3х клеток

Слайд 5Жизнь пыльцы

Слайд 6Пыльцевая трубка как модельный объектГаплоидный геном – легко выявить важные

геныОтсутствие межклеточных контактов – напрямую реагирует на внешние воздействияМалый размер

Слайд 7Ключевые механизмы поддержания полярного роста:Зональная организация цитоплазмы позволяет каждой органелле

быть «в нужное время в нужном месте»Неоднородность в строении клеточной

Слайд 8Везикулярный транспорт и движение органелл по цитоскелету: доставка стройматериалов и

энергообеспечениеКлеточная стенка – механическая составляющаяИонные градиенты и мембранный потенциалГТФазы и

Слайд 9Апикальный (или «растущий») компартментБазальный компартментАпикальный рост пыльцевой трубки поддерживается за

счет полярной организации цитоплазмы. Она разделена на функциональные компартменты:Полярность структуры

Слайд 10Функции циклоза1. Транспорт мужского гаметного модуля (MGU).2. Транспорт в апекс

сигнальных молекул и ферментов для взаимодействия с пестиком.3. Строительные материалы,

Слайд 11Растущий компартментLancelle, Hepler, 1992Брейгина и др., 2009

Слайд 12Цитоскелет

Слайд 13Актиновый цитоскелет играет ключевую роль в поддержании полярного ростаПродольные актиновые

тяжи обеспечивают ток цитоплазмы (фонтан)Кольцевая структура в субапикальной зоне задает

Слайд 14МикротрубочкиОтвечает за транспорт спермиев к зародышевому мешкуОстальные функции неизвестныИнгибиторы не

останавливают рост ПТКинезин идентифицированЧасто располагается вместе с МФ, а также

Слайд 15Рециклирование мембран необходимо для поддержания полярности – «уникальность апекса».В пыльцевой

трубке образование окаймленных пузырьков с клатриновой шубой происходит в субапикальной

Слайд 16Поляризованная секреция поддерживается благодаря актиновому цитоскелету, а также аннексину и

белкам экзоцистного комплексаЭкзоцисты предсталяют из себя октомерный комплекс из белков,

Слайд 17Клеточная стенка: градиент жесткостиДвижущей силой для роста является тургорное давление.

Однако, оно не является векторной силой. За счет чего же

Слайд 18Этерифицированные пектины откладываются в кончике трубки в процессе экзоцитозаПо мере

удаления от кончика они деэтерифицируются при участии фермента пектинметилэстеразы (ПМЕ)Кальций

Слайд 19КаллозаBreygina et al., 2012Xie et al., 2012Отсутствует в кончикеПоявляется на

расстоянии 10-30 мкмОбразует каллозные пробки в длинных трубкахОткладывается в кончике

Слайд 20Жесткий компонент, но его не очень многоОтложение также неравномерное: в

кончике отсутствует, далее постепенно накапливается по направлению к ПЗ.ЦеллюлозаParre, Geitmann,

Слайд 21Регуляторные механизмы: кальцийHepler, 2012Кальций входит в кончике трубки через каналы

, а в субапикальной области входит в органеллы и выкачивается

Слайд 22Кальциевый градиент определяет место слияния везикул с ПМ и, таким

образом, задает направление ростаКальций регулирует динамику актиновых филаментов через Са-чувствительные

Слайд 23В кончике рН кислый, протоны входят в цитоплазму, предположительно, через

неспецифичные катионные каналы. Кислый кончик присутствует только в растущих трубках.В

Слайд 24контрольортованадатфузикокцинБрейгина и др., 2010Градиент мембранного потенциалаконтрольортованадатNPPBБрейгина и др., 2010

Слайд 25Таким образом, пыльцевая трубка – прекрасная модель для изучения ИОННОЙ

РЕГУЛЯЦИИ РОСТА, которая включает в себя Работу ионных каналов и

Слайд 26Регуляторные механизмы: ГТФазыQin, Yang, 2011GFP-NtRab2Маленькие ГТФ-связывающие белки - универсальные переключатели

сигнальных путей. Rab2 осуществляет контроль секреторного пути между ЭПР и

Слайд 27Фосфатидилинозитолдифосфат (PIP2) есть только в апикальной мембране растущих ПТЕго узкая

локализация обеспечивается белком phosphotidylinositol transfer protein (PITP) и фосфолипазой C

Слайд 28ОсцилляцииChebli, Geitmann, 2007

Слайд 29АФК как сигнал от «принимающей стороны»АФК накапливаются в тканях рыльца

различных видов при подготовке к опылению. АФК входят в состав

Слайд 30Экссудат рыльца и экзогенный Н2О2 вызывают гиперполяризацию мембраны пыльцевых протопластовЭффект

экссудата снимается каталазой и тушителем MnTMPPОсновное действующее на МП вещество

Слайд 31АФК как сигнал: H2O2 активирует Ca2+ ток и вход Ca2+

в цитоплазму Breygina et al., 2016. Plant Biol.18: 761-67.H2O2-индуцированный вход

Слайд 32АФК как сигнал: H2O2 активирует ток K+Сравнение средней плотности тока

при (в % от контроля). H2O2 – активирует K+ ток;

Слайд 33АФК как сигнал: H2O2 убирает в трубках «щелочной поясок» В

растущих трубках лилии вслед за массированным входом кальция происходит сглаживание

Слайд 34Два оптических метода оценки EmРатиометрический быстрый краситель Di-4-ANEPPS:Съемка в двух

каналах при возбуждении синим (Fb) и зелёным (Fg) светом –

Слайд 35Количественная флуоресцентная микроскопия: динамика эффекта Проточная цитометрия с красителем DiBAC4(3):

исследование большой популяции протопластовАФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризациюМаксимов и

Слайд 36Гиперполяризация плазмалеммы при действии H2O2 (10 μМ) - распределениеПосле 10

минут инкубации происходит достоверное смещение популяции в область более отрицательного

Слайд 37АФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризацию Количественная флуоресцентная микроскопия с красителем

di-4-ANEPPS: интактные растущие трубки лилииконтроль500 µM H2O2Podolyan et al., 2019

Слайд 38Ca2+K+АДФ + ФнАТФH+Cl-H2O2++??Em

Слайд 39В трубке ион-транспортные системы расположены полярно Они формируют в цитоплазме

динамичные градиенты концентраций, а на мембране – градиент МПАФК-сигнал, приходя

Слайд 40Пероксид водорода вызывает изменения протеома пыльцы. Появляются более 50 белков,

которых не было в контроле.Основные направления: энергетика, метаболизм, синтез белкаВсё

Слайд 41Цветковые VS ХвойныеИзученный модельный объектБыстрый ростУниполярный ростОбращенный фонтанКрутой градиент Са2+Крутой

градиент МПЗависимость от межклеточного взаимодействияОтносительно новый объектМедленный ростВозможность биполярного ростаПрямой

Слайд 42Градиент мембранного потенциалатабакель

Слайд 1Пыльцевая трубка
Основные механизмы полярного роста

Слайд 2Скорость роста – до 1 см/час!
Длина – до десятков сантиметров!
Безошибочная

«адресная» доставка спермиев через ткани пестика
Хранение без потери способности к

Слайд 31824
1847
Ассирийские священники и египетские боги изображались в процессе ритуального опыления

пальмы (5000 лет до н.э.).
Уже тогда было известно, что

Слайд 6Пыльцевая трубка как модельный объект
Гаплоидный геном – легко выявить важные

гены
Отсутствие межклеточных контактов – напрямую реагирует на внешние воздействия
Малый размер

Слайд 7Ключевые механизмы поддержания полярного роста:
Зональная организация цитоплазмы позволяет каждой органелле

быть «в нужное время в нужном месте»
Неоднородность в строении клеточной

энергообеспечение
Клеточная стенка – механическая составляющая
Ионные градиенты и мембранный потенциал
ГТФазы и

Слайд 9Апикальный (или «растущий») компартмент
Базальный компартмент
Апикальный рост пыльцевой трубки поддерживается за

счет полярной организации цитоплазмы. Она разделена на функциональные компартменты:
Полярность структуры

Слайд 10Функции циклоза
1. Транспорт мужского гаметного модуля (MGU).
2. Транспорт в апекс

сигнальных молекул и ферментов для взаимодействия с пестиком.
3. Строительные материалы,

Слайд 11Растущий компартмент
Lancelle, Hepler, 1992
Брейгина и др., 2009

Слайд 13Актиновый цитоскелет играет ключевую роль в поддержании полярного роста
Продольные актиновые

тяжи обеспечивают ток цитоплазмы (фонтан)
Кольцевая структура в субапикальной зоне задает

Слайд 14Микротрубочки
Отвечает за транспорт спермиев к зародышевому мешку
Остальные функции неизвестны
Ингибиторы не

останавливают рост ПТ
Кинезин идентифицирован
Часто располагается вместе с МФ, а также

Слайд 15Рециклирование мембран необходимо для поддержания полярности – «уникальность апекса».
В пыльцевой

белкам экзоцистного комплекса
Экзоцисты предсталяют из себя октомерный комплекс из белков,

Слайд 17Клеточная стенка: градиент жесткости
Движущей силой для роста является тургорное давление.

Слайд 18Этерифицированные пектины откладываются в кончике трубки в процессе экзоцитоза
По мере

удаления от кончика они деэтерифицируются при участии фермента пектинметилэстеразы (ПМЕ)
Кальций

Слайд 19Каллоза
Breygina et al., 2012
Xie et al., 2012
Отсутствует в кончике
Появляется на

расстоянии 10-30 мкм
Образует каллозные пробки в длинных трубках
Откладывается в кончике

Слайд 20Жесткий компонент, но его не очень много
Отложение также неравномерное: в

кончике отсутствует, далее постепенно накапливается по направлению к ПЗ.
Целлюлоза
Parre, Geitmann,

Слайд 21Регуляторные механизмы: кальций
Hepler, 2012
Кальций входит в кончике трубки через каналы

образом, задает направление роста
Кальций регулирует динамику актиновых филаментов через Са-чувствительные

неспецифичные катионные каналы. Кислый кончик присутствует только в растущих трубках.
В

Слайд 24контроль
ортованадат
фузикокцин
Брейгина и др., 2010
Градиент мембранного потенциала
контроль
ортованадат
NPPB
Брейгина и др., 2010

РЕГУЛЯЦИИ РОСТА, которая включает в себя
Работу ионных каналов и

Слайд 26Регуляторные механизмы: ГТФазы
Qin, Yang, 2011
GFP-NtRab2
Маленькие ГТФ-связывающие белки - универсальные переключатели

сигнальных путей.
Rab2 осуществляет контроль секреторного пути между ЭПР и

Слайд 27Фосфатидилинозитолдифосфат (PIP2) есть только в апикальной мембране растущих ПТ
Его узкая

Слайд 28Осцилляции
Chebli, Geitmann, 2007

Слайд 29АФК как сигнал от «принимающей стороны»
АФК накапливаются в тканях рыльца

различных видов при подготовке к опылению.
АФК входят в состав

Слайд 30Экссудат рыльца и экзогенный Н2О2 вызывают гиперполяризацию мембраны пыльцевых протопластов
Эффект

экссудата снимается каталазой и тушителем MnTMPP
Основное действующее на МП вещество

в цитоплазму
Breygina et al., 2016. Plant Biol.18: 761-67.
H2O2-индуцированный вход

Слайд 32АФК как сигнал: H2O2 активирует ток K+
Сравнение средней плотности тока

при (в % от контроля).
H2O2 – активирует K+ ток;

Слайд 33АФК как сигнал: H2O2 убирает в трубках «щелочной поясок»
В

Слайд 34Два оптических метода оценки Em
Ратиометрический быстрый краситель Di-4-ANEPPS:
Съемка в двух

Слайд 35Количественная флуоресцентная микроскопия: динамика эффекта
Проточная цитометрия с красителем DiBAC4(3):

исследование большой популяции протопластов
АФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризацию
Максимов и

Слайд 36Гиперполяризация плазмалеммы при действии H2O2 (10 μМ) - распределение
После 10

Слайд 37АФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризацию
Количественная флуоресцентная микроскопия с красителем

di-4-ANEPPS: интактные растущие трубки лилии
контроль
500 µM
H2O2
Podolyan et al., 2019

Слайд 38Ca2+
K+
АДФ + Фн
АТФ
H+
Cl-
H2O2
+
+
?
?
Em

Слайд 39В трубке ион-транспортные системы расположены полярно
Они формируют в цитоплазме

динамичные градиенты концентраций, а на мембране – градиент МП
АФК-сигнал, приходя

которых не было в контроле.
Основные направления: энергетика, метаболизм, синтез белка
Всё

Слайд 41Цветковые VS Хвойные
Изученный модельный объект
Быстрый рост
Униполярный рост
Обращенный фонтан
Крутой градиент Са2+
Крутой

градиент МП
Зависимость от межклеточного взаимодействия

Относительно новый объект
Медленный рост
Возможность биполярного роста
Прямой

Слайд 42Градиент мембранного потенциала
табак
ель

Слайд 43Биполярное прорастание у ели
Breygina et al., 2019
(в соавторстве с

Слайд 44Две трубки, а МГМ один. Куда же он пойдет?
Он тоже

сомневается…
b
a
c
d
Биполярное прорастание: ядро
Breygina et al., 2019

Слайд 45Биполярное прорастание: динамика
2 часа
6 часов
9 часов
Сколько разрывов – столько и

трубок
Breygina et al., 2019

Слайд 46Биполярное прорастание характерно для мешковой пыльцы
Мы описали феномен и посмотрели,

можно ли на него повлиять
Снова АФК!
Биполярное прорастание: почему?
Breygina et

Слайд 47Никита Максимов, сотрудник
Саша Подолян, студент магистратуры
Группа репродуктивной физиологии растений МГУ
Группа

в контакте: http://vk.com/club83308044

Катя Клименко, сотрудник

Слайд 48Спасибо за внимание!

Работы выполнены при поддержке
РФФИ (19-04-00282 рук. М.

Брейгина, 18-34-00979 рук. Н. Максимов)
РНФ 19-74-00036 (рук. М. Брейгина)

Конфокальные