Изучение методов Микроскопии, техника микроскопии

Микроскоп широко применяется в большинстве лабораторий медицины и биологии, геологии

и материаловедения.
Полученные с помощью микроскопа результаты необходимы при постановке точного диагноза, при контроле над ходом лечения. С использованием микроскопа происходит разработка и внедрение новых препаратов, делаются научные открытия.

смотрю), оптический прибор для получения увеличенного изображения мелких объектов и

их деталей, не видимых невооруженным глазом.
Глаз человека способен различать детали объекта, отстоящие друг от друга не менее чем на 0,08 мм. С помощью светового микроскопа можно видеть детали, расстояние между которыми составляет до 0,2 мкм. Электронный микроскоп позволяет получить разрешение до 0,1-0,01 нм.
Изобретение микроскопа, столь важного для всей науки прибора обусловлено, прежде всего, влиянием развития оптики. Некоторые оптические свойства изогнутых поверхностей были известны еще Евклиду (300 лет до н.э.) и Птоломею (127-151 гг.), однако их увеличительная способность не нашла практического применения. В связи с этим первые очки были изобретены Сальвинио дели Арлеати в Италии только в 1285 г. В 16 веке Леонардо да Винчи и Мауролико показали, что малые объекты лучше изучать с помощью лупы.

Йансеном (Z. Jansen). Изобретение заключалось в том, что Захариус Йансен

смонтировал две выпуклые линзы внутри одной трубки, тем самым, заложив основы для создания сложных микроскопов. Фокусировка на исследуемом объекте достигалось за счет выдвижного тубуса. Увеличение микроскопа составляло от 3 до 10 крат. И это был настоящий прорыв в области микроскопии! Каждый свой следующий микроскоп он значительно совершенствовал.

исследовательские приборы постепенно начали свое развитие, закладывая фундамент современной микроскопии.
Быстрое

распространение и совершенствование микроскопов началось после того, как Галилей (G. Galilei), совершенствуя сконструированную им зрительную трубу, стал использовать ее как своеобразный микроскоп (1609—1610), изменяя расстояние между объективом и окуляром.

lincei") И. Фабером был предложен термин "микроскоп". Первые успехи, связанные с

применением микроскопа в научных биологических исследованиях, были достигнуты Гуком (R. Hooke), который первым описал растительную клетку (около 1665 г.). В своей книге "Micrographia" Гук описал устройство микроскопа.

подробно обсуждало своеобразное положение. Голландец Левенгук (A. van Leenwenhoek) описывал изумительные чудеса,

которые открывал своим микроскопом в капле воды, в настое перца, в иле реки, в дупле собственного зуба. Левенгук с помощью микроскопа обнаружил и зарисовал сперматозоиды различных простейших, детали строения костной ткани (1673—1677).

он увидел впервые кровеносные тельца, движение крови в капиллярных сосудах

хвоста головастика, полосатость мускулов. Он открыл инфузории. Он впервые погрузился в мир микроскопических одноклеточных водорослей, где лежит граница между животным и растением; где движущееся животное, как зеленое растение, обладает хлорофиллом и питается, поглощая свет; где растение, еще прикрепленное к субстрату, потеряло хлорофилл и заглатывает бактерии. Наконец, он видел даже бактерии и в великом разнообразии. Но, разумеется, тогда не было еще и отдаленной возможности понять ни значение бактерий для человека, ни смысла зеленого вещества - хлорофилла, ни границы между растением и животным.

линзу, создал окуляр современного типа. В 1673 г. Гавелий ввел

микрометрический винт, а Гертель предложил под столик микроскопа поместить зеркало. Таким образом, микроскоп стали монтировать из тех основных деталей, которые входят в состав современного биологического микроскопа.

идея Саллига, воспроизведенная французской фирмой Шевалье. Объектив, раньше состоявший из

одной линзы, расчленен на части, его начали изготовлять из многих ахроматических линз. Так умножено число параметров, дана возможность исправления ошибок системы, и стало впервые возможным говорить о настоящих больших увеличениях - в 500 и даже 1000 раз. Граница предельного видения передвинулась от двух к одному микрону. Далеко позади оставлен микроскоп Левенгука.
В 70-х годах 19 века победоносное шествие микроскопии двинулось вперед- Аббе (Е. Abbe).

одной десятой микрона.
Во-вторых, в построении микроскопа вместо грубой эмпирики введена

высокая научность.
В-третьих, наконец, показаны пределы возможного с микроскопом, и эти пределы завоеваны.

а некоторые электронные микроскопы позволяют увеличивать изображение в 2 млн.

раз.

окуляр, заключенные в цилиндрический корпус – тубус. Большинство моделей, предназначенных

для биологических исследований, имеют в комплекте три объектива с разными фокусными расстояниями и поворотный механизм, предназначенный для их быстрой смены – турель, часто называемую револьверной головкой. Тубус располагается на верхней части массивного штатива, включающего тубусодержатель. Чуть ниже объектива (или турели с несколькими объективами) находится предметный столик, на который устанавливаются предметные стекла с исследуемыми образцами. Резкость регулируется с помощью винта грубой и точной настройки, который позволяет изменять положение предметного столика относительно объектива.

(микрометренной)      фокусировки 6. Револьверная головка 7. Объектив 8. Предметный столик

×40
б) иммерсионный ×90
Предметный столик
Конденсор
Макрометрический винт
Микрометрический винт
Винт конденсора
Зеркало
Общее увеличение микроскопа =

увеличение объектива × увеличение окуляра

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

увеличение, которое дает микроскоп, определяется как произведение увеличения объектива на

увеличение окуляра. Однако увеличение не характеризует качества изображения, оно может быть четким и нечетким. Четкость получаемого изображения характеризуется разрешающей способностью микроскопа, т.е. той наименьшей величиной объектов или их деталей, которые можно увидеть с помощью этого прибора.
Общее увеличение Г микроскопа при визуальном наблюдении определяется по формуле:
Г = βоб × βок
где:
βоб - увеличение объектива (маркируется на объективе);
βок - увеличение окуляра (маркируется на окуляре).
Диаметр поля, наблюдаемого в объекте, Доб мм, определяется по формуле:
Доб= Док × βоб.
Док -диаметр окулярного поля зрения(маркируется на окуляре)
 

Определение увеличения и диаметра наблюдаемого поля на объекте

светового микроскопа.
Источник света естественный или искусственный (различные лампы). Свет

собирается в конденсор и далее направляется через препарат в объектив. Окуляр дополнительно увеличивает это изображение.
Качество изображения (четкость) определяется разрешающей способностью микроскопа, т.е. минимальным (разрешающим) расстоянием, на котором оптика микроскопа позволяет различить раздельно две близко расположенные точки. Эта величина пропорциональна длине световой волны и для обычного светового микроскопа равна приблизительно 0,2 мкм. Чем меньше разрешающее расстояние, тем выше разрешающая способность микроскопа и тем более мелкие объекты можно исследовать.
Увеличение микроскопа – это соотношение между истинными размерами исследуемого объекта и размерами его изображения, получаемого с помощью микроскопа. Ориентировочно оно оценивается как произведение увеличений объектива и окуляра и может достигать 2500 раз.

не попадающими в объектив.
При наличии объекта в поле зрения

свет отражается от него и направляется в объектив.
Метод часто используется для изучения живых неокрашенных клеток.

направляется поляризованный пучок света, т.е. лучи света направлены строго в

одной плоскости.
Это обеспечивает особый фильтр – поляризатор. Такой свет направляется на объект исследования.
Второй фильтр – анализатор расположен между объективом и окуляром и позволяет регистрировать угол отклонения плоскости поляризации света.
Микроскопия позволяет регистрировать пространственное расположение молекул в объективе или кристаллические структуры.

Кристаллы оксалатов. Поляризационная микроскопия. Увеличение х100

бесцветных объектов, в частности, позволяет изучать живые неокрашенные препараты.
Даже при

очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает фазовый рельеф). Эти фазовые изменения, не воспринимаемые глазом, преобразуются с помощью специального оптического устройства (кольцевой диафрагмы в конденсоре и фазовой пластинки в объективе) в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом.
Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.

Семенники крысы.
Неокрашенный препарат. Фазовый контраст

Семенники крысы. Окраска: гематоксилин-эозин
Световая микроскопия

Pseudotrichonympha grassi. Неокрашенный препарат. Фазовый контраст

Источником света служат специальные лампы.
Существует аутофлюоресценция – собственная или

первичная флюоресцен-ция. Например, свечение эластических волокон в стенке артерий.
Вторичная флюоресценция возникает после обработки препаратов специальными красителями – флюорохромами (акридин оранжевый, родамин, флюоресцин и др.).
Например: после обработки акридиновым оранжевым в клетке очень четко обнаруживается ядерная ДНК (ярко-зеленое свечение) и РНК (ярко-красное свечение). После фиксации тканей в парах формальдегида (метод Фалька) обнаруживается ярко-зеленое свечение серотонина, катехоламинов (адреналин, норадреналин).
Если флюоресцентные красители связать со специфическими антителами – можно будет выявить их антигены. Этот метод получил название иммуноцитохимического.

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия

окрашивания.
Актиновые микрофиламенты окрашены в красный, микротрубочки — в зеленый,

ядра клеток — в голубой цвет.

.

.

.

.

Нуклеиновые кислоты в эпителии маточных желез.
Окраска акридиновым оранжевым.
Ядерная ДНК окрашена в зеленый цвет, РНК – в красный.

Симпатические нервные сплетения. Метод Фалька

максимальным увеличением до 106 раз. Это стало возможно благодаря использованию

вместо светового потока пучка электронов, длина волны которого во много раз короче длины волны фотонов видимого света.
Электронный микроскоп состоит из электронной пушки (устройства для получения пучка электронов) и системы электромагнитных линз, размещенных в колонне микроскопа в условиях вакуума.
Разрешающая способность электронного микроскопа в 1000÷10000 раз превосходит разрешение светового микроскопа и для лучших современных приборов может составлять менее 0,1 нм (10-10м).
Существуют две основные разновидности электронной микроскопии: трансмиссионная (просвечивающая) и сканирующая (растровая).

том, что электроны, проходя через объект, расположенный вблизи объективной линзы,

взаимодействуют с его атомами и отклоняются от первоначального направления падения пучка (рассеиваются). Далее они попадают в систему магнитных линз, которые формируют на флуоресцентном экране (и на фотопленке) изображение внутренней структуры объекта. При этом удается достичь разрешения порядка 0,1 нм, что соответствует увеличениям до 1,5•106 раз.
Разрешение и информативность ТЭМ-изображений во многом определяются характеристиками объекта и способом его подготовки. Для получения контрастного изображения применяют ультратонкие срезы (не более 0,01 мкм), обработанные соединениями тяжелых металлов (импрегнация солями свинца, урана, осмия и др.), избирательно взаимодействующими с компонентами микроструктуры (химическое контрастирование). При этом чем большей рассеивающей способностью обладает участок исследуемого объекта (участки повышенной плотности, увеличенной толщины и пр.), тем более темным будет его изображение.

в сканировании поверхности образца сфокусированным электронным пучком и анализе отраженных

от нее частиц и рентгеновского излучения, возникающего в результате взаимодействия электронов с веществом.
В СЭМ пучок электронов (электронный зонда) фокусируется электромагнитными линзами конденсора и объектива. Специальное устройство – дефлектор отклоняет электронный пучок (первичные электроны), который скользит по поверхности (растр). Вторичные электроны (отраженные от поверхности) воспринимаются детектором и фокусируются на экране СЭМ, создавая ее трехмерное изображение.
Современный СЭМ позволяет работать в широком диапазоне увеличений приблизительно от х10 (что эквивалентно увеличению сильной ручной линзы) до х1 000 000, что приблизительно в 500 раз превышает предел увеличения лучших оптических микроскопов.
Поверхность сканирования обязательно напыляется металлом: платина, золото, палладий и др.

от повреждений.
Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать его

мягкой тканью, предварительно удалив пыль, а затем обтирать сухой мягкой чистой тканью. Необходимо содержать в чистоте металлические части микроскопа.
Особое внимание следует обращать на чистоту оптических деталей, в первую очередь объективов и окуляров.
Для предохранения оптических деталей насадок от пыли необходимо оставлять окуляры в окулярных тубусах или надевать на окулярные тубусы колпачки.
Не следует касаться пальцами поверхностей оптических деталей. В случае если на последнюю линзу объектива, окуляра глубоко сидящую в оправе, попала пыль, поверхность линзы надо очень осторожно продуть резиновой грушей, либо прочистить мягкой (беличьей) кисточкой или чистой ватой, навернутой на деревянную палочку и слегка смоченной эфиром или спиртовой смесью.
Будьте особенно внимательны при работе с объективами большого увеличения. Не допускайте случайного соприкосновения фронтальной линзы объектива с покровным стеклом исследуемого препарата – это может привести к повреждениям поверхности фронтальных линз.
Не установленные в револьверную головку объективы храните в футляре, ввёрнутыми в крышку!
Не следует самостоятельно разбирать объективы, окуляры и другие узлы микроскопа. Обращайтесь к специалистам.

помещениях или в помещениях с повышенной влажностью, в помещениях, где

ощущаются толчки и вибрации. В помещении не должно быть паров кислот, щелочей и других химически активных веществ. Следует избегать попадания на микроскоп прямых солнечных лучей.

При транспортировании или хранении микроскопа в упаковке при отрицательной температуре перед распаковыванием необходимо выдержать микроскоп в упаковке в помещении при температуре от 10 до 35ºс не менее четырех часов.

Микроскопы рассчитаны на эксплуатацию в макроклиматических районах с умеренным и холодным климатом при температуре воздуха в помещениях от 10 до 35ºС. Работать с объективами масляной иммерсии следует в помещении при температуре воздуха от 15 до 25ºС.

который обеспечивает одновременно с подключением к питающей сети заземление корпуса

микроскопа.
Замену лампы в осветителе микроскопа и плавких вставок (предохранителей) следует производить при отключенном от сети микроскопе. Во избежание ожога кожи рук о колбу лампы или контактные штыри замену лампы следует производить через 15 - 20 мин после отключения микроскопа от сети.
После окончания работы микроскоп необходимо отключить от сети.
Не рекомендуется оставлять без присмотра включенный в сеть микроскоп.
Ремонтные и профилактические работы следует про изводить только после отключения микроскопа от сети.

стекле
Используются чистые предметные обезжиренные стекла желательно толщиной 1 мм

.
Капля крови помещается в середине стекла в 1-2 см от одного из концов.
Шлифованное стекло, которым будет сделан мазок, ставят на предметное стекло под углом 30-45 градусов на 1-2 мм перед каплей и двигают его немного назад, чтобы стекло соприкоснулось с каплей крови и капля растеклась по углу между двумя стеклами.
Далее быстро проводят движение вперед по предметному шлифованным стеклом, которое должно быть уже предметного или специальным пластиковым шпателем, позволяющим получить монослойный мазок практически на всем его протяжении.
Мазок должен иметь длину 3-4 см. Не следует сильно нажимать на стекло, так как при этом травмируются форменные элементы крови.
Мазки высушивают на воздухе и маркируют.

быть тонким, желтоватого цвета, располагаться на 1-1,5 см от краев

и оканчиваться «метелочкой».


В толстых (густо-розового цвета) мазках морфология клеток плохо различима. После окрашивания эритроциты при микроскопии должны располагаться отдельно друг от друга в виде монослоя.

Существует 2 типа автоматических приборов для производства равномерных мазков крови, в основе которых используется механическое распределение клеток или центрифугирование (Cytospin фирмы Shandon). Цитоцентрифуга концентрирует клетки на небольшой площади и такие мазки используют для изучения клеток в низких концентрациях, например, в спинномозговой жидкости. В современных гематологических анализаторах имеется устройство для автоматического приготовления мазков с последующей их фиксацией и окрашиванием, что еще больше сокращает время приготовления препаратов и обеспечивает постоянство характеристик окраски. Данные приборы требуют стандартных стекол размером 26x76x1 (фирма «Гем)

Паппенгейму-Крюкову
Существуют автоматические устройства для приготовления и окраски мазков, которые

позволяют стандартизировать условия и повысить качество препаратов.

НПФ "Абрис+"), удобные в применении и дающие хорошие результаты при

окраске мазков. Можно использовать наборы для быстрого окрашивания мазков крови в течение 20-30 секунд (фирма "Гем").

Автоматическая фиксация и окраска мазков может быть осуществлена с помощью специальных устройств: "Гема-Тек" (США), "ПОМК-1" (Россия), в которые загружают нефиксированные мазки. Последующее автоматическое дозирование фиксатора-красителя и буферных растворов обеспечивает стандартную и равномерную окраску мазков.

образца крови сразу после взятия в течение не более 10-15

минут, после чего в крови происходят необратимые изменения. Капельку крови под покровным стеклом изучают сначала обзорно под малым увеличением, затем анализируют морфологию клеток и содержимое плазмы под иммерсией при максимальном увеличении. Важным отличием данного метода от обычных анализов является проведение исследования образца крови без какой-либо его предварительной обработки и в присутствии пациента. Пациент имеет уникальную возможность видеть свои клетки и в процессе исследования получать важнейшую для него информацию.

Метод исследования нативной крови под микроскопом известен науке со времен изобретения самого микроскопа. Обычная световая микроскопия, применяемая в лабораторной практике сегодня, максимально позволяет увеличивать просматриваемые объекты в 1500 раз. Этого достаточно для просмотра структуры окрашенных препаратов, но не дает возможности оценки динамических процессов в крови. Модернизация световой микроскопии современной техникой позволила добиться максимально эффективного увеличения визуализируемых структур и объектов плазмы, причём, в их динамике и оценить жизнедеятельность клеток крови. Таким образом, на основе световой микроскопии появился новый метод исследования, общепринятое название которому в настоящее время не определено.

генциановым фиолетовым с докраской фуксином по Граму все микроорганизмы делят

на грамположительные (фиолетовый цвет) и грамотрицательные (красный).
Туберкулезные микобактерии окрашивают по Цилю-Нильсену карболовым фуксином в красный цвет, а все остальные части препарата докрашивают метиленовым синим

проявляются неокрашенные микроорганизмы, например, бледная спирохета.

парафином или желатином, нарезание тончайшими слоями при помощи прибора-микротома. Полученные

срезы окрашивают сложными смесями красителей. Срезы закрепляют на предметных стеклах смесью белка с глицерином. Для сохранения препаратов срезы заливают канадским бальзамом и покрывают предметным стеклом. Бальзам засыхает, и в таком виде гистологический препарат сохраняется в течение многих лет.

с помощью вогнутого зеркала, собирающего рассеянный пучок света, и конденсора

достигают равномерного освещения поля зрения.
На предметный столик помещают препарат покровным стеклом вверх.
Изучение начинают при малом увеличении (объектив х8), при этом расстояние между объективом и покровным стеклом должно быть около 1 см. Установку резкости проводят с помощью макровинта.
Рассматривают детали по всей площади, перемещая его на предметном столике.
Устанавливают в центр поля зрения , который следует изучить при большом увеличении (объектив х40).
С помощью револьверного устройства ставят объектив с более сильным увеличением (х40). Установку резкости проводят с помощью микровинта.
Для изучения очень мелких структур используют иммерсионный объектив (х90).
На покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионного масла.
Осторожно опускают тубус до соприкосновения линзы объектива к маслу.
Установку резкости проводят с помощью микровинта.
После окончания работы иммерсионное масло удаляют с объектива и покровного стекла марлей.

гематоксилин-эозин. Увеличение: х 280 (большое увеличение).
Почка. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: х 630 (иммерсионное

увеличение).