Биохимические подходы в интерактомике

выделяют с помощью специфического антитела . 
Выбор антител является ключевым звеном в данной

технологии!!!
Антитела должны быть
высокоаффинными
высокоспецифичными
Используются антитела как
моноклональные ( более специфичны, но менее толеранты к изменениям антигена) так и
поликлональные( более толерантны к изменениям антигена, но менее специфичны)

– выделен из Streptococcus.
Оба белка связываются с Fc- доменов иммуноглобулинов

очень хорошо.

в данном подходе отсутствует этап добавления антител в клеточный лизат.

Целевой белок с включенным в его состав меткой в комплексе с белками-партнерами сразу выделяется из лизата с помощью аффинного сорбента.
Различные метки: эпитопы типа Myc (пептидный эпитоп из фактора транскрипции c-Myc) , FLAG (октапептид N-DYKDDDDK-C) ; GST(глутатион-S-трансфераза ; 6хHis – специфическая пептидная метка в виде 6 остатков гистидина;
аффинный сорбент - сефароза, ионообменная смола или микрочастицы с закрепленным на нем аффинным реагентом (антитела для выделения белков, меченных пептидными эпитопами; глутатион для выделения белков, меченных GST; нитрилотриуксусная кислота (NTA) для выделения белков с 6хHis-меткой).

с 3-4 гистидинами подряд.

Примечание: D= аспарагиновая кислота, Y= тирозин, K

= лизин.

из клеточного лизата путем одновременного использования двух аффинных меток в

составе целевого белка.
Типичный вариант ТАР основан на использовании генно-модифицированного целевого белка с двумя аффинными метками, разделенными специфическим сайтом TCS (пептидная последовательность ENLYFQG) разрезания белковой цепи протеиназой вируса гравировки табака (Tobacco Etch Virus, TEV).
В качестве меток используются: белок А из S. aureus (или его IgGсвязывающий домен) и кальмодулинсвязывающий пептид (СВР) .
ТАР-технология имеет два основных преимущества:
все процедуры выполняются в близких к физиологическим условиях,
отмывки белковых комплексов происходят в мягких условиях, не вызывающих их разрушения.

счет связывания первой метки (белок А) с аффинным сорбентом, содержащим

IgG и отмывки. Далее целевой белок разрезается TEV-протеиназой с отделением белка А, который остается на сорбенте, и открытием доступа к СВР. При этом белковый комплекс смывается с сорбента.

ионов кальция на микрочастицах с иммобилизованным кальмодулином (СМ). После аккуратной

отмывки осуществляется элюция белкового комплекса путем связывания ионов кальция комплексоном (EGTA), что приводит к распаду комплекса СВР-СМ.