БИОИНЖЕНЕРИЯ №5 315-й межгалактический съезд биоинженеров. Бетельгейзе, 2747

на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременной детекцией сигнала,

генерируемого в ходе проведения ПЦР.

Обычная

ПЦР

ВРЕМЕНИ»
Несмотря на различие в конечной концентрации продуктов реакции, появление регистрируемого

прибором сигнала для всех пробирок произошло одновременно, что свидетельствует о схожести начального количества ДНК.

нужно каким-то образом визуализировать.
Визуализация накопления ПЦР-продукта
ФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ!!!

Интенсивность флуоресцентного сигнала SYBR Green пропорциональна количеству наработавшегося двуцепочечного продукта

реакции.

димеров праймеров!)
-Невозможность проведения мультиплексной ПЦР


Чтобы компенсировать эти недостатки, были придуманы

системы «флюорофор – гаситель».

связаны с ДНК в непосредственной близости друг от друга. Энергия

передается с флюорофора на гаситель и испускается последним с другой длиной волны (флюоресцирующий гаситель).

В. Флюорофор и гаситель связаны с ДНК в непосредственной близости друг от друга. Энергия передается с флюорофора на гаситель и диссипирует (темновой гаситель).

соединения ароматической природы.

инвертированным повтором, по краям которого расположены флуорофор и гаситель. При

температуре элонгации инвертированный повтор образует шпилечную структуру, в которой флуорофор и гаситель сближены. В ходе синтеза второй цепи ДНК шпилечная структура
«разворачивается» и интенсивность флуоресценции возрастает.

б — праймер содержит меченый 5'-адаптер, комплементарный дополнительному олигонуклеотиду с гасителем. Синтез второй цепи «сталкивает» олигонуклеотид с гасителем.

один из которых несет флуорофор, а другой — гаситель флуоресценции.
В

отсутствие мишени проба образует дуплекс, в котором флуоресценция подавлена. При накоплении соответствующего пробе продукта реакции процесс реассоциации пробы начинает конкурировать с процессом гибридизации олигонуклеотидов на мишень, что ведет к увеличению уровня флуоресценции.

! Проба – это не праймер!
С пробы амплификация не идет, она просто с чем-нибудь связывается.

концевой повтор, по краям которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции.

В растворе проба
формирует шпилечную структуру, в которой флуорофор и гаситель
сближены.

При гибридизации со специфичным продуктом реакции проба «разворачивается», что ведет к разобщению флуорофора и гасителя и, как следствие, к усилению флюоресценции.

и нет!

5’-экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Активность эта «биоинженерная» - в рекомбинантный белок

добавлен соответствующий домен.

проба находится в растворе, за счет близкого расположения гаситель эффективно

поглощает энергию флуорофора. В случае гибридизации со специфичным продуктом реакции проба разрушается за счет 5'-экзонуклеазной активности полимеразы, что ведет к разобщению флуорофора и гасителя и возрастанию
флуоресценции.

N0—количество целевых молекул в начале реакции (на первом цикле);
Nn—количество

продуктов реакции на цикле n;
2 — коэффициент эффективности ПЦР.

Реалистическая ПЦР:

Е – коэффициент эффективности, находящийся в интервале от 1 до 2.

Отличие значения Е всего на 0,15 к 30-му циклу ПЦР дает разницу в количестве продукта в 10 раз!

флуоресценции;
а - (неизвестный) коэффициент пропорциональности;
N - число молекул

ДНК.

Коэффициент а зависит от:
- настроек прибора, параметров реакционной
пробирки, точности разнесения реактивов по пробиркам и т. д.
системы визуализации накопления ДНК (интеркалирующие красители, олигонуклеотидные зонды, меченые праймеры и т. д.).

При сравнении разных экспериментов или даже разных пробирок внутри одного эксперимента полученные данные нельзя сравнивать напрямую: коэффициент для них может отличаться.

довольно просто).
Пороговый метод: определение момента Ct (выраженного в циклах ПЦР),

когда количество ДНК в реакционной пробирке (а следовательно, и флуоресцентный сигнал) достигает одинаковой для всех образцов пороговой величины Nt (задается пользователем или программным обеспечением). Сравнивая полученные значения Ct, можно судить о начальных концентрациях ДНК в исследуемых образцах.

Для корректной работы порогового метода, необходимым является сходство коэффициентов преобразования уровня флуоресценции в количество ДНК.

Логарифмическая шкала
Информативен только экспоненциальный

участок!

одной пробирке?

волны испускаемой тьмы к разным молекулам ДНК и используйте прибор

с возможностью детекции нескольких глубин волн – и все у вас будет ништяк!