CRISPR / Cas9 система

экспериментальной биологии с момента изобретения ПЦР» (комментарий в журнале “Nature”,

2015 г.)

прерывающихся коротких палиндромных повторов
1987 – открытие странных участков в геноме

E. coli, состоящих из чередований повторов и уникальных спейсерных последователь-ностей (Японцы). Случайно, статья вообще не про это.
1995-2002 – обнаружение широкой распространенности CRISPR у бактерий и архей. Использовали в качестве «штрих-кода» для опознания видов и штаммов микроорганизмов.

21-35 п.о.

21-35 п.о.

установлено их родство с хеликазами.
2003 – (быстрое расширение баз данных

по секвенированным геномам) обнаружено соответствие спейсерных последовательностей фрагментам геномов фагов (вирусов) и некоторых плазмид.
2006 – показано, что CRISPR вместе с группой белков Cas обеспечивают противофаговую защиту у микроорганизмов.
2008-2010 – расшифрован механизм работы системы CRISPR/Cas противофагового иммунитета.
2011 – в экспериментах на E.coli установили минимальный необходимый набор компонентов системы (группа из Литвы, рук. Шикшнис): CRISPR + Cas9
2012 – Дженифер Дудна с коллегами (Калифорния) разработали технологию модификации генома на основе системы CRISPR/Cas. Одновременно аналогичную технологию предложила и группа из Литвы, но Калифорнийская система оказалась компактнее.
С 2013 – быстрое появление все новых модификаций этой технологии и ее адаптация под решение широкого круга экспериментальных задач в области молекулярной биологии клеток, биологии онтогенеза, генетических заболеваний и др.

которая совмещает в себе функции crRNA (комплементарное спаривание с целевой

последовательностью) и tracrRNA (привлечение эндонуклеазы Cas). Эта гидРНК кодируется одним геном длиной около 100 п.о. и экспрессируется с промоторов для РНК полимеразы III.
Созданы искусственные варианты гена эндонуклеазы Cas9 c нуклеотидной последовательностью, адаптированной под систему трансляции целевого организма (оптимизированные наборы кодонов) + пришит сигнал ядерной локализации.
Создаются разнообразные варианты гена с измененными функциями и характеристиками.

Дженнифер Дудна (статья за 2012 год)

Беспозвоночные: Растения:
Лягушка Дрозофила Кукуруза
Аксолотль Водяная блоха Рис
Рыбы

Аскарида Сорго
Мышь Шелкопряд Апельсин
Крыса Табак
Обезьяна Пшеница
Кролик Свинья Человек Арабидопсис
Томат

моделей для изучения генетических заболеваний.
Медицинское применение: диагностика, лечение инфекционных, генетических,

онкологических заболеваний.
Биотехнологическое применение: создание новых белков, животных и растений с новыми полезными для человека свойствами.
Борьба с вредителями (генный драйв).
Функциональные исследования: расшифровка функции генов, изучение поведения клеток в организме.
Эволюционные исследования: поиск значимых (полезных) мутаций, благодаря которым адаптировались разные виды.

мутаций. 3) Отработка возможных подходов к лечению (лекарства, стволовые клетки, реверсия

к норме при помощи редактирования CRISPR/Cas и пр.) В настоящее время ряд фирм делает мышей и крыс с нужными мутациями под заказ.

в ген тирозиназы.
Тирозиназа – фермент, необходимый для синтеза меланина.

Починив ген

обратно, из альбиносов получили темных мышей.

кардиомиопатия
Гиперхолестеринемия (Ген PCSK9)
Гемофилия
Мышечная дистрофия
Прогерия (преждевременное старение)
Атрофия сетчатки глаз
Тирозинемия (нарушение

синтеза белка, истощение)
Болезнь Хантигтона (атрофия нейронов мозга)
Аутизм
Муковисцидоз
Серповидно-клеточная анемия, талассемия
Катаракта
Онкологии

(2016)
Обнаружили новую мутацию, связанную с тяжелой формой семейной гемофилии B

– в факторе 9 системы свертывания крови.
Получили мутантную больную мышь, при помощи модификации одноклеточного эмбриона с использованием CRISPR/Cas.
Молодым и взрослым мышам вводили внутривенно плазмиды или аденовирусные векторы для экспрессии гидРНК, белка Cas9 под специфичным для печени промотором и нормальный вариант последовательности F9. Ген встраивался в заданную область генома.
Редактирование прошло примерно в 1% клеток печени (при введении голых плазмид).
Получили устойчивую нормализацию свертываемости крови.

опухолей. Отключение гена-подавителя иммунитета в лимфоцитах (ex vivo). 86 пациентов

(большинство уже умерли от диагностированного рака).
C 2017 – аналогичные испытания в США.
С октября 2018 – в Европе. Терапия серповидно-клеточной анемии – патологии эритроцитов из-за мутации в гене гемоглобина. 12 пациентов.
С 2019 – планируется в США. Терапия врожденных дефектов сетчатки (потеря зрения) из-за мутации в генах LCA10, USH2A, RPE65 или CEP290. Рассчитывают привлечь по 10-20 пациентов. Особенность – проведение in vivo (введение компонентов системы CRISPR/Cas напрямую в сетчатку). Система названа EDIT-101.

высокую эффективность.
Не навредить по недостатку знаний.
Варианты применения:
Лечение взрослых редактированными

клетками (ex vivo).
Лечение взрослых введением системы для редактирования в определенные участки организма (in vivo).
Раннее лечение введением системы в эмбрион внутри матки.
Редактирование генома на стадии одноклеточного зародыша.

найдены в 2015 году (США)

(генетически обусловленная нейродегенерация).
Из-за мутантного гена накапливается вредный белок в нейронах,

вызывая их гибель.

туберкулезу (вводили дополнительный ген, обеспечивающий иммунитет к туберкулезу). 2016 г.

Разрез со «ступенькой» существенно повышает вероятность репарации по механизму гомологичной рекомбинации!

г.)
Эффективность замещения в эксперименте составила 15-85%. Повреждение ДНК – не

чаще 1%. Как пример – в гене PCSK9 мышей.

точнее и с большим выбором сайтов
3 варианта фермента из менингококка

Neisseria meningitidis

Новорожденных мышат: 5
Альбиносы – 2
Мозаики (серо-белые) – 3
Токсичность – 0
Редактированной ДНК 84-100%

2015 г. В настоящее время проводится также в Китае, США,

России. Максимальная продолжительность разрешенных экспериментов – 14 дней. Цели: 1) отработка технологии (с перспективой на применение в будущем); 2) изучение роли генов и их мутаций в ранних событиях эмбрионального развития человека. Поиск причин женского бесплодия (выкидыши).

April 2015
Оплодотворение
In vitro
Материал на выброс (2-5 %)
Развивается до

стадии бластоцисты

Микрошприцем вводили в оплодотворенную яйцеклетку:
мРНК Cas9
мРНК Gfp
gRNA, нацеленную на ген бета-гемоглобина (HBB)
ssDNA с областями гомологии и некоторыми заменами
Результаты:
Эффективность введения – 71 из 86 (83%)
Внесение надреза в гене HBB – 28 из 54 (52%)
Внесение ожидаемых замен – 4 из 28 (14%)
6 из 6 проверенных эмбрионов были мозаиками, содержали мутации HBB типа indel, и имели дополнительные мутации в неспецифичных участках генома.

genetics and genomics, март 2017
(статья представлена в июле 2016) Китай
Эксперименты

проводили на здоровых 2N зиготах; гены HBB и G6PD, исправляли мутации, связанные с талассемией и фавизмом.
Зиготы получали оплодотворением яйцеклеток с нормальным вариантом спермой от гетерозиготного мужчины.
Микрошприцем вводили в оплодотворенную яйцеклетку в G2 фазе:
белок Cas9; gRNA, нацеленную на ген-мишень
ssDNA с нужным участком гена (нормальный аллель)
Результаты:
Эффективность введения – 6 из 6 (100%)
Разрез и редактирование – 6 из 6 (100%)
Редактирование по пути HDR – 1 из 4 для гена HBB; 2 из 2 для GAPDH
Полное секвенирование проведено для 1 эмбриона, при этом неспецифических изменений генома в нем не обнаружено.

мужчины.
Мутация в гене MYBPC3 вызывает в гетерозиготном состоянии гипертрофическую кардиомиопатию.
Всего

использовали 22 зиготы (и 10 контрольных).
Ожидаемое число нормальных зигот – 50%
По результатам эксперимента – 72%.
Гомологичная рекомбинация прошла с материнской хромосомой.
Эффективность редактирования около 50%.
Мозаицизма и неспецифических мутаций не выявлено.

Октябрь 2018 – российская статья о редактировании CCR5 у эмбрионов
Ноябрь 2018 – заявление Хе о рождении детей с редактированным CCR5.

Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos (2017, Миталипов, США)

Паркинсона, ишемии.
Редактирование при помощи CRISPR позволило создать из индуцированных стволовых

клеток человека органоиды почек для тестирования лекарств от почечной болезни (2018)

2019)
Каждая клетка предъявляет иммунной системе «паспорт» (молекулы MHC I и

MHC II) по которым иммунная система может отличить свои клетки от чужих.
Чужие клетки уничтожаются Т лимфоцитами;
«Беспаспортные клетки» - естественными киллерами (NK).
В результате привитые чужие клетки отторгаются. Приходится подавлять иммунную систему и пациент становится уязвимым для инфекции.
При помощи CRISPR были сломаны два гена, необходимые для предъявления MHC I и MHC I, а обычной модификацией добавлен ген, отменяющий срабатывание клеток NK.
Результат: у мышей приживались стволовые клетки от других мышей! Без подавления иммунной системы!
А что, если так получать клетки, вырабатывающие инсулин для пациентов с аутоиммунным диабетом???

НО: берегитесь рака!!!

ген будет отключен (при помощи CRISPR), зачаток почек разовьется из

клеток человека, в которых ген SALL1 рабочий.
Обоснование: регуляция развития внутренних органов млекопитающих почти идентична.
НО: некоторые части почки (напр. кровеносные сосуды) все равно будут содержать клетки свиньи!

На практике получалось использовать такой подход в экспериментах с химерами из клеток крыс и мышей. Но не всегда. С сердцем почему-то не получилось.

Почему свинья, а не шимпанзе?
Сложно и дорого
Неэтично

малых количеств РНК (вируса).
Схожая система DETECTR для детекции ДНК, с

ферментом Cas12a (2017).

с массой замечательных свойств. Но попутно появились и не такие

приятные свойства, от которых сложно избавиться.
Выход: зная, какие гены ответственны за нужные признаки, заново начать с диких растений и изменить гены только там, где требуется.
20 продуктов готовят к выпуску на рынки США в ближайшие годы.

повышенный шанс появления мутации с изменением заданного признака (окно можно

делать от 20 до 350 нуклеотидов – в зависимости от конкретной версии белка).

Тест на частоту появления устойчивых бактерий

раковой опухоли

Тубулин (иммуноокраш.) DAPI
Nock-in
Ядерный белок


Белок цитоплазмы

и специфичность генной модификации клеток и организмов, а следовательно, экономия

денег и времени.
Возможность работы с множеством различных биологических объектов, в том числе тех, которые не являются классическими модельными объектами.
Возможность ориентации одновременно на большое число геномных локусов.
Гибкая адаптация системы под решение широкого круга научных и практических задач: модификация генома, регуляция активности генов, прижизненное наблюдение за компонентами клетки и др.

гидРНК

и незаметно. А соблазн поиграться в Бога велик.
Риск грубых ошибок

или злонамеренного вредительства действительно есть, и вопрос о механизмах контроля действительно серьезный.

Здоровье
Сельское хозяйство
Биоразнообразие