Экспериментальные методы исследований

– распространение единого электромагнитного поля в пространстве. Одномерное волновое уравнение

в данном случае:


где - относительная диэлектрическая проницаемость среды
- электрическая постоянная
- относительная магнитная проницаемость среды
-  магнитная постоянная

в вакууме:

Скорость распространения электромагнитных волн равна скорости света.

Интенсивность волны:
где и средние по времени значения модулей векторов напряженности электрического и магнитного поля.

оптика, рассматривает проблемы, связанные с изучением природы света и световых

явлений.
Свет, или оптическое излучение, представляет собой волны электромагнитного поля.
Световые волны являются плоскопоперечными; они распространяются в однородной и изотропной средах перпендикулярно направлению электрического и магнитного полей и описываются волновыми уравнениями Максвелла. Скорость света, или скорость распространения электромагнитных волн в вакууме (с), равняется 2,9979·108 м·с-1.

полных колебаний напряженности электромагнитного поля, совершаемых в единицу времени (в

1 с). Оптическое излучение, характеризующееся одной частотой световых колебаний, называется монохроматическим.

Расстояние, на которое распространяется в данной среде фронт монохроматической световой волны за один период световых колебаний, получило название длины волны.

Величина, обратная длине световой волны, называется волновым числом.

отражении, преломлении, дифракции, интерференции, поляризации света; эти физические явления изучает

волновая оптика.
Однако свет испускается и поглощается веществом в виде строго определенных порций энергии, сконцентрированных в световых квантах фотонов. В этом проявляется двойственный корпускулярно-волновой характер его природы.
Корпускулярные свойства света проявляются в процессах люминесценции, спектрах испускания и поглощения, явления фотоэффекта, они подчиняются законам квантово механики и исследуются квантовой оптикой.

света) и волновой характеристикой излучения (частота) , устанавливает формула Планка:


Совместное

использование волновой и квантовой теорий света позволяет наиболее полно, точно и всестороннее охарактеризовать те или иные явления и процессы, обусловленные действием света.

принято разделять на следующие диапазоны:
вакуумный (ВУФ) – 1-200 нм,
коротковолновый (КУФ)

– 200-280 нм,
средневолновый (СУФ) – 280-315 нм,
длинноволновый (ДУФ) – 315-400 нм.
В медицине существует разделение УФ-излучения на УФ-А (ДУФ), УФ-В (СУФ) и УФ-С (КУФ) – диапазоны.

света.
Преломление света.
Рассеяние света в случае неоднородности вещества и среды, которое

влечет за собой также дифракцию и интерференцию света.
Поглощения света веществом, сопровождающееся ослаблением светового потока, флуоресценцией и фосфоресценцией.
Линейная поляризация света при прохождении его через некоторые кристаллы (турмалин, герапатит и др.)
Вращение плоскости поляризации света при прохождении его через оптически активные вещества: кварц, аминокислоты (кроме глицина), полипептиды, белки, нуклеиновые кислоты.
Двойное лучепреломление света при прохождении его фотонов через призмы, изготовленные из исландского шпата (СаСО3).
Явление внешнего и внутреннего фотоэффекта.
Вынужденное (индуцированное) или лазерное излучение.

(одна из сред обязательно должна быть прозрачна) происходит отражение света:

световая волна возвращается частично или полностью от границы раздела в среду, из которой она падает без изменения своей длины.
Интенсивность отраженного света зависит от качества отражающей поверхности.
Если поверхность имеет неровности с размерами ≥ длине волны падающего света, то наблюдается диффузное отражение света. Если же размеры неровностей на поверхности раздела двух сред < < длины волны падающего излучения, то поверхность оптически гладкая, а отражение света - зеркальное .

падающим лучом и нормалью, восстановленной из точки падения на отражающей

поверхности (границы разделы двух сред).




При этом отраженный и падающий лучи располагаются по разные стороны от нормали.
Угол отражения равен углу падения .

плотной среды в менее плотную.
При угле падения луча света

меньше некоторой величины ( ) происходит обычное преломление луча света и частичное отражение его от границы раздела двух сред.
Если угол падения луча
превышает данную
предельную величину,
то на границе раздела таких
сред луч света не преломляется,
а полностью отражается от границы раздела.

стекла или пластмассы (полистирол, полиметилметакрилат, политетрафторэтилен) и имеющих разные показатели

преломления. Основное требование: показатель преломления оболочки по своей величине меньше, чем показатель преломления сердцевины; что позволяет свету при прохождении по оптическому волокну претерпеть ряд последовательных полных внутренних отражений на границе раздела оболочки и сердцевины и лишает луч возможности выхода за пределы отдельного волокна.

путем скрепления только на концах (гибкие конструкции) или сплавляя вместе

до слияния оболочек (жесткие конструкции). Световоды могут передавать на большие расстояния без значительных потерь энергии свет различного диапазона (средний и ближний ИК, видимый, УФ до 200 нм) и лазерное излучение.
В медицине с диагностическими целями световоды используют при фиброгастроскопии, бронхоскопии, ректораманоскопии, цистоскопии и др.

по отражению, которая изучает свойства света, отраженного веществом, и позволяет

определить коэффициент зеркального отражения :


где и - соответственно интенсивности отраженного и падающего световых потоков, и - показатели преломления прозрачной и отражающей среды, - коэффициент поглощения.

отражения (НПВО).
В этом случае исследуется явление полного внутреннего отражения на

границе среды, способной поглощать свет, из-за чего происходит ослабление светового потока и нарушение ПВО – <1. Метод НПВО применяется для изучения биосистем с показателем поглощения в диапазоне значений .

света; - интенсивность отраженного света; n1 и

n2 - соответственно показатели преломления 1-й и
2-й среды; - показатель поглощения 2-й среды.

водных растворов разработаны высокочувствительные спектрометры на основе ослабленного полного отражения

(ATR – attenuated total reflection) лазерного излучения. Материалом для изготовления ATR-призм служит, например, германий. Объект исследования, например, какая-либо биологическая ткань, прижимается к одной из сторон призмы и в зависимости от своих спектральных свойств поглощает какую-то часть световых волн, проникающих в оптически менее плотную среду при ПВО.

луч лазера;
2 - ATR-призма;
3 - Объект исследования;
4 - регистрирующий
детектор.
 

Излучение от газового лазера (CO2-лазера) падает под определенным углом на ATR-призму и отражается (в предельном угле полного внутреннего отражения) на переменных сторонах призмы .

позволяет определять содержания в них различных биологических соединений (глюкозы, мочевины,

холестерина и т.д.). Методу присущи: высокая разрешающая способность, независимость от толщины исследуемого объекта, чувствительность в сотни раз превышающая традиционные биохимические методы исследования

используемых методов, позволяющий довольно просто определить концентрацию вещества, находящегося в

растворенном состоянии, или определить концентрацию двухкомпонентных растворов. Данный метод основан на явлении преломления, т.е. изменении прямолинейного распространения света при переходе из одной среды в другую, называемого рефракцией.  

в том числе, показатель преломления.
Преломление света веществом и распространение его

в среде осуществляется в полном соответствии с законами волновой оптики.
Луч света при прохождении из менее оптически плотной среды в более плотную частично отражается от второй среды частично входит в нее, при этом он преломляется и меняет свое направление.

к границе раздела сред, проведенная через точку падения, лежат в

одной плоскости.
В случае использования монохроматического света отношения синуса угла падения к синусу угла преломления для двух изотропных сред есть величина постоянная, не зависящая от угла падения (закон преломления Снеллиуса):

С учетом изменения не только направления луча света, но и

его скорости в результате преломления абсолютный показатель преломления определяется как отношение скорости распространения света в вакууме
к скорости света в преломляющей среде
:

смещение связующих пар внешних (оптических) электронов в сторону более электроотрицательного

атома и образуются диполи.
Диполи совершают вынужденные колебания с частотой, равной частоте падающей световой волны. Данные диполи являются источниками вторичных сферических волн. В результате интерференции вторичных и падающей волны образуется плоская волна.
Различные соединения среды и вещества имеют разную преломляющую способность (из-за разной поляризуемости).
Показатель преломления вещества – безразмерная величина. Для каждого вещества это индивидуальная характеристика, зависящая от его природы, температуры, длины волны падающего света, концентрации в единице объема (для растворов) и давления (для газов).

плотность :

Впервые уравнение, устанавливающее связь между этими двумя

параметрами, было предложено И. Ньютоном (1704):
Он же ввел в оптику понятие рефракции (refractive power) – светопреломляющей силы вещества .

величины при изменении плотности прозрачного вещества под влиянием давления, при

изменении температуры и т.д.

Сопоставление значений относительной плотности воздуха при разных давлениях с рефракцией и показателем преломления

состояния вещества.
Для жидкостей предложена формула Гладстона  Даля:


для изотропных

сред – формула Лоренц  Лорентца:

Формула Лоренц  Лорентца идеально выполняется для изотропных сред (газы,

неполярные жидкости) только при прохождении через них видимого света и УФ  излучения, так как при воздействии частот именно данных диапазонов света поляризуемость вещества является именно электронной.
При более низких частотах колебаний электромагнитного излучения возможны смещения не только электронов, но и ионов и атомов, что может привести к ионной и атомной поляризуемости молекул.

других видов рефракции.
В физической химии определяют рефракцию сложного вещества

по рефракциям составляющих его элементов.
Существует также понятие физиологической рефракции, связанное со строением и функционированием оптической системы глаза. В данном случае рефракция – это преломляющая способность глаза, зависящая от двух факторов: силы оптической системы глаза и размеров (длины) глазного яблока.

распространения света в данной среде. Величина поляризуемости зависит от соотношения

частоты световой волны и частот собственных колебаний молекул. Отсюда следует, что величина показателя преломления вещества зависит от частоты (длины волны) проходящего света. Зависимость называют рефрактометрической дисперсией (иногда, просто дисперсией) .

изменением длины волны света. Были введены условные обозначения отдельных линий

некоторых химических элементов, используемых для определения и .
Разность показателей преломления,
измеренная на двух различных
длинах волн, называют частной
дисперсией ( ).
Эта величина используется для
идентификации веществ.

граничным линиям средней части спектра С и F. Линия С

– красная линия в спектре водорода ( 656,3 нм). Линия F – синяя линия в спектре водорода ( 486,1 нм). Разность ( - ) называют средней дисперсией.
В рефрактометрах типа Аббе измерения проводят для желтой линии спектра натрия – 589,2 нм.

nλ2
Средняя или главная дисперсия
∆FC=( nF- nC)·104
Относительная дисперсия
WFCD=( nF- nC)/

( nD- 1)·103
WFC=( nF- nC)/ ( nC- 1)·103

веществ увеличивается с уменьшением длины волны. Эту зависимость называют нормальной

дисперсией.
Для окрашенных веществ в полосах поглощения видимой части спектра наблюдается обратная зависимость: величина показателя преломления
уменьшается при
движении
в коротковолновую
сторону,
что соответствует
аномальной
дисперсии.

показателю преломления, рефракции и дисперсии света.
Влияние структуры органических соединений на

величину дисперсии значительно сильнее, чем на величину рефракции.

веществ. Измерения показателя преломления различных химических соединений проводили еще И.Ньютон,

М. Ломоносов.
Для биологии особый интерес представляют методы, позволяющие осуществлять витальные (прижизненные) измерения показателя преломления микрорганизмов и животных клеток. Разработки таких методов начались еще в 18 в. (де Шольне, 1767).
Наиболее удачным оказался метод иммерсионной рефрактометрии, совмещающий рефрактометрию и микроскопию (принцип качественного сравнения показателя преломления биообъекта и эталонной иммерсионной среды).

- покровное и предметное стекла; 3 - иммерсионная жидкость с

частицами испытуемого материала; р - луч света; 4 - зрительная труба микроскопа; I, II - поле зрения микроскопа при несовпадении и совпадении показателей преломления испытуемого материала и иммерсионной жидкости соответственно.

до четвертого знака, что позволяет определять n биообъекта с точностью

±0,001.
Среды должны быть прозрачными, изотропными, безвредными, химически инертными, обладать изотоничностью и изоосмотичностью, перекрывать диапазон n=1,360 ±1,420, характерный для биологических клеток.
Используют водные растворы сывороточного альбумина человека (недостаток – подвижность клеток), а также водно-глицериновые гели желатины (недостаток – питательная среда для роста бактерий).

измерение смещения интерференционных полос монохроматического света при сравнении показателей преломления

двух сред (интерферометры)
Фотометрический. Метод минимальной мутности. Основан на измерении интенсивности рассеянного света при разных показателях преломления.
И другие.

С помощью данных методов, например, по предварительно составленным расчетным таблицам,

определяют содержание тех или иных веществ в биологических жидкостях организма человека.
Рефрактометрическими методами измеряют содержание белка в сыворотке крови или лиофильно высушенных биопрепаратах крови: сывороточном альбумине, фибриногене и др.
Рефрактометрически устанавливают содержание воды и концентрацию сухих веществ в бактериальной клетке, плотность бактерий, объемную концентрацию бактерий в суспензии.
С помощью циторефрактометрии можно изучать рост бактерий, дифференцировать живые и мертвые клетки бактерий.

колебаниями этой величины в зависимости от изменения концентрации вещества в

процессе эксперимента, т.е. за градиентом показателя преломления, лежат в основе некоторых биофизических методов исследования (аналитическое ультрацентрифугирование, электрофорез, диффузия).
При измерении величины квантового выхода люминесценции вещества необходимо предварительно осуществлять калибровку спектрофлуориметра по показателю преломления исследуемых растворов.
При изучении структуры биологических молекул методом дисперсии оптического вращения также необходимо знание показателя преломления растворителя и растворённого вещества.