Компьютерные методы анализа нуклеотидных последовательностей

Дизайн праймеров для ПЦР и для секвенирования ДНК.

vitro. C помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В

обычном ПЦР-процессе длина продукта составляет не более 3 т.п.н. С помощью смеси различных полимераз и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов.

праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК (Forward-Reverse,

Sense Antisense, Upper-Lower).
• Термостабильная ДНК-полимераза
• Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
• Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции

ПЦР

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.

температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером.

Простой расчет оптимальной температуры отжига праймера: Tm = [(A+T) x 2 °C] + [(G+C) x 4 °C](если суммарная длина олигонуклеотида не превышает 20 оснований)
Tm = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T))(если суммарная длина олигонуклеотида составляет 20-30 оснований) или
Tm= 64.9 +41 x (G+C-16.4)/(A+T+G+C)
Обычно мы выбираем температуру отжига на 3-5oС меньше, чем температура плавления олигонуклеотидов.

100.5 + (41 x (G+C)/(A+T+G+C)) - (820/(A+T+G+C)) + 16.6 x

log10([Na+]) или для длинных олигонуклеотидов:
Tm= 81.5 + (41 x (G+C)/(A+T+G+C)) - (500/(A+T+G+C)) + 16.6 x log10([Na+]) 
Концентрация соли = [Na+]+[K+]+0.7[Tris].

высокая температура отжига - более высокая специфичность. Но как только

она превышает некую критическую (для данной пары праймеров), количество продукта начинает резко снижаться.

%;
близкие Tm праймеров (отличия не более, чем на 5 °C);
желательно,

чтобы на 3’-конце был гуанин или цитозин / последние несколько нуклеотидов 3' - конца праймера содержали GC-основания
отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек и димеров (особенно на 3’-конце);

и образование димеров праймеров, 3'-концы которых образуют прочные связи.

старта (Hot-start PCR) .
Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR )

Параметры обычной

PCR реакции.
Td=95oC, 1';

25-30 циклов:
Td=94oC, 10'', Ta=55 oC, 30'', Te=72oC, 1';

T=72oC, 5';
T=4oC. 

амплификации, открыть меню Analyze и выбрать команду Find PCR Primers.

В результате появится диалоговое окно:

амплификации, открыть меню Primer Design выбрать команду Find Primers Inside

Selections. В результате появится диалоговое окно:

к 5’ концу праймера короткую последовательность;
Сформулировать требования к гомологии праймера

(Primer Similarity);
Задать биохимические и структурные параметры праймеров;
Определить требования к качеству праймеров.

праймер необходимо записать как обратно комплиментарный)
«Буквы» только английские
Масштаб синтеза и

требуемый вид очистки

составленные или на основе относительно консервативной последовательности нуклеотидов какого-либо гена

из мультигенного семейства. Зачастую такой праймер будет представлять собой весьма гетерогенную смесь олигонуклеотидов. Применение остатков инозина, образующего комплементарные пары с любым из четырех дезоксинуклеотидов, в вырожденных местах таких праймеров в значительной степени решает эту проблему

Вырожденные праймеры

фрагменте.
В случае слитых последовательностей – проверка непрерывности ОРТ.
Расчет праймеров и

введение последовательностей сайтов рестрикции на 5' концах праймеров (дополнительные нуклеотиды для работы ферментов.
https://www.neb.com/

изучаемой последовательности (перекрывание, длина чтения)

ensure good hybridization.
• Avoid runs of an identical nucleotide, especially

guanine, where runs of four or more Gs should be avoided.
Избегать 4 и более G
• Keep the G-C content in the range 30–80%.
• For cycle sequencing, primers with melting temperatures (Tm) above 45 °C produce better results than primers with lower Tm.
• For primers with a G-C content less than 50%, it may be necessary to extend the primer sequence beyond 18 bases to keep the Tm>45 °C.
• Use of primers longer than 18 bases also minimizes the chance of having a secondary hybridization site on the target DNA.
• Avoid primers that have secondary structure or that can hybridize to form dimers.
• Several computer programs for primer selection are available.

probe first and design the primers as close as possible

to the probe without overlapping it. Amplicons of 50 to 150 bp are strongly recommended. · keep primer/probe GC content within 30-80% · avoid runs of identical nucleotides, this is especially true for guanine, where runs of four or more Gs should be avoided
When designing primers: · Tm should be within 58°C to 60°C · the last 5 bases at the 3 prime end should have no more than two G's or C's · keep the annealing Ts of the primers as close as possible · select primer pairs with minimal number of potential primer dimers and primer hairpins as possible
When designing probes: · Tm should be within 68°C to 70°C · no Gs on the 5’ end · select the strand that gives the probe more C than G bases · make the TaqMan probes as short as possible, without being shorter than 13 nucleotides