Разделы презентаций


Лекция 6 Анализ взаимодействий in vitro

Содержание

Стратегия: от белка к гену Изолировать белок на основе его функциональной активности (например, энзиматической или гормональной) Частично определить последовательность аминокислот Синтезировать олигонуклеотиды, соответствующие определенным последовательностям аминокислот Использовать олигонуклеотиды как пробы

Слайды и текст этой презентации

Слайд 1Лекция 6
Анализ взаимодействий
in vitro


Лекция 6    Анализ взаимодействий in vitro

Слайд 2Стратегия: от белка к гену


Изолировать белок на основе его

функциональной активности
(например, энзиматической или гормональной)

Частично определить последовательность аминокислот

Синтезировать олигонуклеотиды, соответствующие
определенным последовательностям аминокислот

Использовать олигонуклеотиды как пробы для отбора из
библиотеки кДНК или геномного клона, кодирующих этот
белок

Определить последовательность нуклеотидов
изолированного клона



Стратегия: от белка к гену Изолировать белок на основе его функциональной активности (например, энзиматической или гормональной) Частично

Слайд 3Определение
последовательности
аминокислот
с помощью метода
деградации по Эдману
фенилизотиоцианат
гидролиз
Цикл 1
Цикл 2
Идентификация

аминокислотных остатков
гидролиз

Определение последовательности аминокислот с помощью методадеградации по ЭдмануфенилизотиоцианатгидролизЦикл 1Цикл 2Идентификация аминокислотных остатковгидролиз

Слайд 4Стратегия: от гена к белку


Изолировать геномный клон, соответствующий измененному

белку в
мутанте (например, ауксотрофия, наследственные болезни, дефект

развития)

Использовать геномную ДНК для изолирования кДНК, кодирующей
этот ген

Определить последовательность нуклеотидов изолированной кДНК для выведения последовательности аминокислот кодируемого ею белка

Сравнить выведенную последовательность аминокислот с
последовательностью нормального белка

Использовать экспрессионный вектор для получения мутантного
белка


Стратегия: от гена к белку Изолировать геномный клон, соответствующий измененному белку в  мутанте (например, ауксотрофия, наследственные

Слайд 5Взаимодействия двух белков
in vivo
in vitro
центрифугирование

хроматография

ко-иммунопреципитация

Blot-overlay

Pull-down

Surface Plasmon Resonance

бесклеточные модельные системы
контролируемые условия

Взаимодействия двух белковin vivoin vitro центрифугирование хроматография ко-иммунопреципитация Blot-overlay Pull-down Surface Plasmon Resonance бесклеточные модельные системыконтролируемые условия

Слайд 6Электрофорез белков в полиакриламидном геле
Определение содержания белка во фракциях
Выделение

белка для последующего анализа
Оценка чистоты препарата
Определение молекулярной массы
SDS
100ºC

SH-
реагент

Додецилсульфат натрия (Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) – анионный детергент; его молекулы сообщают любой полипептидной цепи отрицательный заряд, величина которого пропорциональна длине цепи,
поэтому все белки движутся к аноду.


Скорость этого движения обратно пропорциональна логарифму массы молекулы, – хотя плотность заряда одинакова,- молекулы делятся по размеру из-за тормозящего действия геля.

SH

S

SH

S

Электрофорез белков в полиакриламидном гелеОпределение содержания белка во фракциях Выделение белка для последующего анализаОценка чистоты препарата Определение

Слайд 7 Двумерный электрофорез


максимальное разрешение белков в геле
-

-

+

+

без SDS, но в мочевине
деление по заряду молекулы

в присутствии SDS,
деление по молекулярной массе

градиент рН

-

+

первое направление,
амфолины

второе направление

300-900 Д

Двумерный электрофорез –   максимальное разрешение белков в

Слайд 8 10 мкг белка

14С-метка

825 часов
экспозиции
1100 белков

E. сoli, разделенные с помощью


двумерного электрофореза

(P. O’Farrell, 1974)

10 мкг белка 14С-метка 825 часов  экспозиции1100 белков E. сoli, разделенные с помощью

Слайд 9Окрашивание белков в геле и на мембране
SDS-гель
перенос на

мембрану
Ag (0,1-1 ng)
Coomassie
(1-2 мкг)
Cu++
элюция
из геля
масс-спектрометрия
Ponceau S
иммуноокрашивание
идентификация
+

Окрашивание белков в геле и на мембранеSDS-гель  перенос на мембрану Ag (0,1-1 ng)Coomassie (1-2 мкг)Cu++элюцияиз гелямасс-спектрометрияPonceau

Слайд 10 Масс-спектрометрия MALDI-TOF
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization

- Time Of Flight
UV лазер (330-360 nm )
катод
анод
сигнал
образец и
матрица

ускорение
разность
потенциалов

вакуум

детектор

Принципиальная схема устройства масс-спектрометра

дрейф

Масс-спектрометрия MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time Of FlightUV лазер (330-360 nm

Слайд 11белковое пятно вырезают из геля
белок переваривают трипсином; смесь пептидов
вносят

в масс-спектрометр и получают спектр
количество
отношение масса/заряд
MALDI-TOF
поиск в базе белковых последовательностей

совпадения с теоретическими
массами, рассчитанными для всех триптических пептидных продуктов

идентификация белка и изолирование соответствующего гена

белковое пятно вырезают из гелябелок переваривают трипсином; смесь пептидов вносят в масс-спектрометр и получают спектрколичествоотношение масса/зарядMALDI-TOFпоиск в

Слайд 12отдельный пик белка,
очищенного хроматографией
пептиды, полученные обработкой
очищенного белка трипсином
первый

масс-спектр дает
массы пептидов
каждый пептид дальше фрагментируется
по пептидным связям
массы фрагментов

для каждого пептида
определяются на втором масс-спектре

количество

отношение масса/заряд

разница в массах между фрагментами
позволяет составить последовательность
пептида

отдельный пик белка, очищенного хроматографиейпептиды, полученные обработкой очищенного белка трипсиномпервый масс-спектр даетмассы пептидовкаждый пептид дальше фрагментируется по

Слайд 13Центрифугирование: угловой ротор
сила гравитации в
ультрацентрифуге

Fs=mω r

супернатант
осадок
Type 45 Ti
6 x 94

mL


20 x 0.2 mL

TLA-100

сила трения

Архимедова сила

2

Центрифугирование: угловой ротор сила гравитации в ультрацентрифуге       Fs=mω rсупернатантосадокType 45 Ti6

Слайд 14градиент плотности
отверстие
частицы возрастающей плотности
сила гравитации
TLS-55
4 x 2.2

mL
6 x 39 mL
SW 28
Центрифугирование: бакет (bucket) -ротор
сила трения
Плавучая плотность

в CsCl, г/см
ДНК: 1,69-1,73, (в воде 1,1, собственная ок.2)
РНК: более 1,9
Белки: 1,30-1,33

3

градиент плотностиотверстие частицы возрастающей плотности  сила гравитацииTLS-554 x 2.2 mL6 x 39 mLSW 28Центрифугирование: бакет (bucket)

Слайд 15 Аналитическое ультрацентрифугирование
S – константа седиментации

(сек)
10 сек = 1 S (Svedberg)
-13
постоянная
скорость
сила трения
Архимедова

сила

сила гравитации

S20,W - коэффициент седиментации

o

o

70S=30S+50S рибосомы прокариот
80S=40S+60S рибосомы эукариот

Fs + Fb + Ff = 0

Аналитическое ультрацентрифугированиеS – константа седиментации (сек)10  сек = 1 S (Svedberg)-13постоянная

Слайд 16Дифференциальное осаждение
гомогенат
целые клетки

ядра
элементы цитоскелета
митохондрии
лизосомы
хлоропласты
пероксисомы
микросомы

мелкие везикулы

рибосомы
вирусы

цитозоль

Предосторожности при лизисе клеток:
Температура
рН
Ингибиторы протеаз, фосфатаз, киназ
Детергенты?

1000 х g 10 мин.

10000 x g
10 мин.

80000 x g
60 мин.

150000 x g
3 часа

Размеры субклеточных структур
Фракции в виде осадков

Дифференциальное осаждениегомогенат    целые клетки        ядраэлементы цитоскелетамитохондрии лизосомыхлоропластыпероксисомы

Слайд 17Наиболее популярные детергенты
неионные
ионные
Triton X-100

Octylglucoside

(-)Sodium Deoxycholate

(-)Sodium Dodecylsulfate

(+)Цетавлон = Cetyltrimethylammonium bromide

Наиболее популярные детергентынеионныеионныеTriton X-100

Слайд 18Детергенты растворяют гидрофобные белки
детергентно-липидные

мицеллы
Детергент
Детергентно-белковые
мицеллы
Детергентные
мицеллы
Фрагментация
Липидно-белковая


мембрана

ККМ - критическая концентрация
мицеллообразования

> ККМ

амфифильность

(гидрофильные и
гидрофобные области)

детергент

мембрана

Детергенты растворяют гидрофобные белкидетергентно-липидные       мицеллыДетергентДетергентно-белковые

Слайд 19Центрифугирование в градиенте плотности
Седиментация:
непрерывный линейный градиент
формируется в процессе центрифугирования
Плавучая

плотность ДНК в градиенте CsCl
Седиментация:
непрерывный линейный градиент,
сформированный заранее
Например,

градиент сахарозы (органеллы)

Седиментация:
ступенчатый градиент,
сформированный заранее

Флотация:
ступенчатый градиент,
сформированный заранее

Центрифугирование в градиенте плотностиСедиментация:непрерывный линейный градиент формируется в процессе центрифугированияПлавучая плотность ДНК в градиенте CsClСедиментация: непрерывный линейный

Слайд 20Анализ фракций градиента
номера фракций
OD280
концентрация сахарозы
Концентрация сахарозы

Концентрация белка

Энзиматическая активность

Белковый состав фракций

Распределение

интересующего
белка

иммуноблоттинг

Анализ фракций градиентаномера фракцийOD280концентрация сахарозыКонцентрация сахарозыКонцентрация белкаЭнзиматическая активностьБелковый состав фракцийРаспределение интересующего белка иммуноблоттинг

Слайд 21Пример: флотация микротрубочек
(from Fuchs and Westermann)
1
3
5
смесь митохондрий

и микротрубочек
Anti-Nkin2
Предварительная инкубация митохондрий
с антителами против белка Nkin2 семейства кинезина

из N.crassa лишает их способности «поднимать» микротрубочки. Остальные антитела не влияют.

Вопрос: какой из белков на поверхности митохондрий опосредует их связывание с микротрубочками?

Пример: флотация микротрубочек(from Fuchs and Westermann) 135 смесь митохондрий  и микротрубочекAnti-Nkin2Предварительная инкубация митохондрийс антителами против белка

Слайд 22Гель-фильтрация
Аффинная хроматография
Ионообменная хроматография
Виды хроматографии
антитело
пористая гранула
заряженная гранула
Na+
Cl-
DEAE-группа
CM-группа
Na+-форма; щелочные белки
OH- или Cl--формы

Гель-фильтрацияАффинная хроматографияИонообменная хроматографияВиды хроматографииантителопористая гранулазаряженная гранулаNa+Cl-DEAE-группаCM-группаNa+-форма; щелочные белкиOH- или Cl--формы

Слайд 23Pull-down анализ: связывание с рекомбинантным белком,


синтезированным в бактериях

в бактериях

аффинный
домен

аффинный
домен

N

C

бактериальный
лизат

клеточный
экстракт

элюция
глютатионом

Глютатион-S-трансфераза + глютатион
Белок, связывающий мальтозу + мальтоза
6 остатков гистидина + ионы Ni2+

=

глютатион-агароза

Pull-down анализ: связывание с рекомбинантным белком,

Слайд 24 Ко-иммунопреципитация:
нужны антитела к обоим партнерам
bead
А
А
А
А
центрифугирование
и промывание
bead
А
А
А
А
инкубация с

анти-
иммуноблоттинг с анти-
Образуют ли комплекс белки и

?
Ко-иммунопреципитация: нужны антитела к обоим партнерамbeadААААцентрифугированиеи промываниеbeadААААинкубация с анти-иммуноблоттинг с анти- Образуют ли комплекс белки

Слайд 25Пример: взаимодействие двух секретируемых белков
ДНК, кодирующая FLAG-белок А
ДНК, кодирующая Myc-белок

В
Иммунопреципитация антителами к FLAG
Иммуноблоттинг преципитата с антителами к Myc

Пример: взаимодействие двух секретируемых белковДНК, кодирующая FLAG-белок АДНК, кодирующая Myc-белок ВИммунопреципитация антителами к FLAGИммуноблоттинг преципитата с антителами

Слайд 26белки разделяются электрофорезом и переносятся из геля на мембрану
инкубация с

белком-«наживкой»
инкубация с антителами против белка-«наживки»
инкубация со вторичными антителами
проявление
Blot-overlay анализ
сравнение с

гелем
белки разделяются электрофорезом и переносятся из геля на мембрануинкубация с белком-«наживкой»инкубация с антителами против белка-«наживки»инкубация со вторичными

Слайд 27 Surface Plasmon Resonance: анализ взаимодействия очищенных белков или белков

и нуклеиновых кислот
призма
лазер
камера
поляризатор
слой золота
партнер
буфер

Surface Plasmon Resonance: анализ взаимодействия очищенных белков или белков и нуклеиновых кислотпризмалазеркамераполяризаторслой золота партнербуфер

Слайд 28Surface Plasmon Resonance: анализ взаимодействия антиген-антитело

Surface Plasmon Resonance: анализ взаимодействия  антиген-антитело

Слайд 29
Быстрая идентификация продукта гена

Локализация мутаций посредством

синтеза укороченных продуктов

Включение модифицированных
неприродных аминокислот

для
структурных исследований

Исследование сворачивания белка

Изучение влияния разных факторов
на транскрипцию и трансляцию

Биохимическая in vitro система: синтез белка

Быстрая идентификация продукта гена Локализация мутаций посредством  синтеза укороченных продуктов Включение модифицированных  неприродных аминокислот

Слайд 30Обычно используемые системы
1. Экстракт ретикулоцитов кролика.
Ретикулоцит – предшественник

эритроцита, он уже не имеет ядра.
Много эндогенной

мРНК, но она в основном глобиновая: 90%
синтезируемого белка – глобин. Синтез глобина можно использовать
как модель для изучения роли разных факторов в процессах
транскрипции и трансляции. В сопряженной системе используется
фаговая РНК-полимераза.

2. Экстракт зародышей пшеницы. Низкое содержание эндогенной мРНК.

3. Экстракт E. coli. Содержит все, что нужно для транскрипции и
трансляции. Синтез белка идет существенно быстрее, чем в
«эукариотических» системах. Собственные мРНК нужно удалять.
Обычно используемые системы1. Экстракт ретикулоцитов кролика.  Ретикулоцит – предшественник эритроцита, он уже не имеет ядра.

Слайд 31Пример: синтез люциферазы светлячка
в

бесклеточной системе
Вопрос: происходит ли при синтезе в бесклеточной системе E.

coli образование на рибосоме активной конформации каждого из двух пептидов, различающихся по длине их С-концевых участков?

мРНК люциферазы была лишена стоп-кодона, поэтому пептиды оставались связанными с рибосомами.

Пуромицин имитирует аминоацил-тРНК; на него «перебрасывается» С-конец растущего
пептида, высвобождается пептидил-пуромицин, синтез белка прекращается.

Пример: синтез люциферазы светлячка      в бесклеточной системеВопрос: происходит ли при синтезе в

Слайд 32Черные столбики – активность люциферазы
Серые столбики – активность люциферазы


после добавления пуромицина

(from Kolb V. et al.)
оптическая плотность при

280 нм

активность люциферазы

номера фракций

номера фракций

Результат центрифугирования
в градиенте концентрации сахарозы

а)

б)

а) «растущая» люцифераза без удлинения С-конца

б) «растущая» люцифераза, удлинённая на 59 аминокислот с С-конца

Черные столбики – активность люциферазы Серые столбики – активность люциферазы после добавления пуромицина(from Kolb V. et al.)

Слайд 33Лекция 7
Взаимодействия in vivo

Лекция 7 Взаимодействия in vivo

Слайд 34 Электрофорез в неденатурирующих условиях
Химическая сшивка
Иммунопреципитация хроматина
Колокализация в

клетке
Pull-down из клеточного лизата
Дигибридная дрожжевая система
Fluorescence Resonance

Transfer Energy- FRET
Tandem Affinity Purification

С какими молекулами взаимодействует данный
белок in vivo?
Взаимодействуют ли два (три и т.д.) данных
белка в клетке?
С какой последовательностью ДНК взаимодействует данный белок?

Электрофорез в неденатурирующих условиях Химическая сшивка Иммунопреципитация хроматинаКолокализация в клетке Pull-down из клеточного лизата Дигибридная дрожжевая

Слайд 35 Электрофорез белков в неденатурирующих условиях
1. Получение белка в очищенном

нативном виде

2. Определение свойств выделенного белка:

Изменение заряда вследствие химической


модификации или деградации

Модифицированные конформации –
неправильно свернутые, частично
денатурированные…

Олигомеры и агрегаты (как ковалентно,
так и нековалентно связанные)

Взаимодействие белков между собой
или с лигандами

Свойства ПААГ
мембранные белковые
комплексы митохондрий
10 kDa - 10 MDa

(from I. Wittig et al.)

АТФ-синтазная
активность F1, проявленная
непосредственно
в геле (фосфат
свинца в осадке)

0,002% Coomassie G-250 в катодном буфере

рН 7,5

нитрат свинца,
АТФ

Электрофорез белков в неденатурирующих условиях1. Получение белка в очищенном нативном виде2. Определение свойств выделенного белка: Изменение

Слайд 36Фото-активируемые аналоги аминокислот
L-Photo-Leucine и L-Photo-methionine –
аналоги нормальных аминокислот;
присутствуя в

среде, они включаются
в белки в процессе обычной трансляции
Химическая

сшивка белков посредством фотоактивации

рост в среде с
Photo-Leu и
Photo-Met

UV
365 нм

лизис клеток

-

+

результат
сшивки

масс-спектрометрия
гель-хроматография

электрофорез

Фото-активируемые аналоги аминокислотL-Photo-Leucine и L-Photo-methionine – аналоги нормальных аминокислот;присутствуя в среде, они включаются в белки в процессе

Слайд 37Химические сшивки белков
С
О
Н
Н
Простейший способ – «сшить» формальдегидом:
в водной среде
НО
СН2
ОН
белок


белок
СН2
метиленгликоль
Преимущество: cвязывание ковалентно, но обратимо при нагревании,
поэтому возможен анализ

с помощью электрофореза и иммуноблоттинга,
а также последующей масс-спектрометрии

связывание по близким
аминогруппам

Недостаток: нет специфичности в отношении белков, поэтому
белки связываются с нуклеиновыми кислотами, углеводами и т.д.

Химические сшивки белковСОННПростейший способ – «сшить» формальдегидом: в водной средеНОСН2ОНбелок белокСН2метиленгликольПреимущество: cвязывание ковалентно, но обратимо при нагревании,

Слайд 38Химическая сшивка белка с ДНК –
иммунопреципитация хроматина:
идентификация на ДНК

сайта связывания белка
Х
химически сшиваем белок с ДНК
ДНК
регуляторный белок
лизируем клетки

и ядра

нарезаем ДНК на короткие фрагменты

выделяем регуляторный белок и ассоциированный
фрагмент ДНК иммунопреципитацией

Х

Х

удаляем белок, амплифицируем выделенный фрагмент ДНК в PCR и определяем в нем последовательность нуклеотидов

Химическая сшивка белка с ДНК – иммунопреципитация хроматина:идентификация на ДНК сайта связывания белкаХ химически сшиваем белок с

Слайд 39кДНК
эукариотический вектор,
кодирующий белок
+

таг или репортер
клонирование
экспрессия
Экспрессия трансгена в клетках эукариот
локализация белка
выделение

белка

трансфекция

белок, меченный тагом или
слитый с флуоресцентным белком

кДНК  эукариотический вектор,    кодирующий белок + таг или репортерклонированиеэкспрессияЭкспрессия трансгена в клетках эукариот

Слайд 41Доставка крупных молекул в клетки
Микроинъекция: ДНК, мРНК, белок

Липосомная трансфекция:

ДНК, мРНК

Са-фосфатная трансфекция: ДНК

Электропорация: ДНК, мРНК, белок

Вирусная инфекция: ДНК

Фагоцитоз
Доставка крупных молекул в клеткиМикроинъекция: ДНК, мРНК, белок Липосомная трансфекция: ДНК, мРНК Са-фосфатная трансфекция: ДНК Электропорация: ДНК,

Слайд 42таг-1
таг-2
Ко-экспрессия
Иммунопреципитация
антителами против
тага-1
Иммуноблоттинг преципитата
с

антителами против тага-2
Ко-экспрессия возможных партнеров:
использование клетки как пробирки

таг-1таг-2Ко-экспрессияИммунопреципитация антителами против      тага-1Иммуноблоттинг преципитатас антителами против тага-2Ко-экспрессия возможных партнеров: использование клетки

Слайд 43Ко-экспрессия возможных партнеров:
ко-локализация
Перераспределение зиксина в ответ на экспрессию фактора

Xanf-1
(from Martynova et al.)

Ко-экспрессия возможных партнеров: ко-локализацияПерераспределение зиксина в ответ на экспрессию фактора Xanf-1(from Martynova et al.)

Слайд 44фрагмент белка А,
связывающий
иммуноглобулины
белок, специфически
связывающий

калмодулин
в присутствии ионов Са2+
В клетке:
клеточный экстракт,
содержащий комплекс


белка Х и некоего партнера

Tandem Affinity Purification

Х

Y

X

Экспрессия в клетках млекопитающих интересующего белка
в виде fusion с двумя аффинными доменами:

участок расщепления
специфической
вирусной протеазой TEV

интересующий нас
белок Х

фрагмент белка А,   связывающий иммуноглобулины белок, специфически связывающий калмодулин в присутствии ионов Са2+  В

Слайд 45X
Y
X
Y
TEV
X
Y
Ca2+
EGTA
X
Y
анализ
Шаг 1: своим IgG-связывающим
доменом комплекс связывается


с иммуноглобулинами,
иммобилизованными на колонке 1.

Шаг 2: протеаза TEV

отщепляет
комплекс от этого домена.

Шаг 3: в присутствии ионов
Са++ комплекс связывается с
калмодулином,
иммобилизованным
на колонке 2.

Шаг 4: Хелатор Са++ ЭГТА
снимает комплекс с колонки.

Условие: комплекс YX должен сохраняться в присутствии Са2+

XYXYTEV XYCa2+ EGTA XYанализШаг 1: своим IgG-связывающим доменом комплекс связывается с иммуноглобулинами, иммобилизованными на колонке 1. Шаг

Обратная связь

Если не удалось найти и скачать доклад-презентацию, Вы можете заказать его на нашем сайте. Мы постараемся найти нужный Вам материал и отправим по электронной почте. Не стесняйтесь обращаться к нам, если у вас возникли вопросы или пожелания:

Email: Нажмите что бы посмотреть 

Что такое TheSlide.ru?

Это сайт презентации, докладов, проектов в PowerPoint. Здесь удобно  хранить и делиться своими презентациями с другими пользователями.


Для правообладателей

Яндекс.Метрика