Разделы презентаций
- Разное
- Английский язык
- Астрономия
- Алгебра
- Биология
- География
- Геометрия
- Детские презентации
- Информатика
- История
- Литература
- Математика
- Медицина
- Менеджмент
- Музыка
- МХК
- Немецкий язык
- ОБЖ
- Обществознание
- Окружающий мир
- Педагогика
- Русский язык
- Технология
- Физика
- Философия
- Химия
- Шаблоны, картинки для презентаций
- Экология
- Экономика
- Юриспруденция
Лекция 6 Анализ взаимодействий in vitro
Содержание
- 1. Лекция 6 Анализ взаимодействий in vitro
- 2. Стратегия: от белка к гену Изолировать белок
- 3. Определение последовательности аминокислот с помощью методадеградации по ЭдмануфенилизотиоцианатгидролизЦикл 1Цикл 2Идентификация аминокислотных остатковгидролиз
- 4. Стратегия: от гена к белку Изолировать геномный
- 5. Взаимодействия двух белковin vivoin vitro центрифугирование хроматография
- 6. Электрофорез белков в полиакриламидном гелеОпределение содержания белка
- 7. Слайд 7
- 8. 10 мкг белка 14С-метка 825 часов
- 9. Окрашивание белков в геле и на мембранеSDS-гель
- 10. Масс-спектрометрия MALDI-TOF
- 11. белковое пятно вырезают из гелябелок переваривают трипсином;
- 12. отдельный пик белка, очищенного хроматографиейпептиды, полученные обработкой
- 13. Центрифугирование: угловой ротор сила гравитации в ультрацентрифуге
- 14. градиент плотностиотверстие частицы возрастающей плотности сила
- 15. Аналитическое ультрацентрифугированиеS
- 16. Дифференциальное осаждениегомогенат целые клетки
- 17. Наиболее популярные детергентынеионныеионныеTriton X-100
- 18. Детергенты растворяют гидрофобные белкидетергентно-липидные
- 19. Центрифугирование в градиенте плотностиСедиментация:непрерывный линейный градиент формируется
- 20. Анализ фракций градиентаномера фракцийOD280концентрация сахарозыКонцентрация сахарозыКонцентрация белкаЭнзиматическая активностьБелковый состав фракцийРаспределение интересующего белка иммуноблоттинг
- 21. Пример: флотация микротрубочек(from Fuchs and Westermann) 135
- 22. Гель-фильтрацияАффинная хроматографияИонообменная хроматографияВиды хроматографииантителопористая гранулазаряженная гранулаNa+Cl-DEAE-группаCM-группаNa+-форма; щелочные белкиOH- или Cl--формы
- 23. Pull-down анализ: связывание с рекомбинантным белком,
- 24. Ко-иммунопреципитация: нужны антитела к обоим
- 25. Пример: взаимодействие двух секретируемых белковДНК, кодирующая FLAG-белок
- 26. белки разделяются электрофорезом и переносятся из геля
- 27. Surface Plasmon Resonance: анализ взаимодействия очищенных белков или белков и нуклеиновых кислотпризмалазеркамераполяризаторслой золота партнербуфер
- 28. Surface Plasmon Resonance: анализ взаимодействия антиген-антитело
- 29. Быстрая идентификация продукта гена Локализация мутаций
- 30. Обычно используемые системы1. Экстракт ретикулоцитов кролика.
- 31. Пример: синтез люциферазы светлячка
- 32. Черные столбики – активность люциферазы Серые столбики
- 33. Лекция 7 Взаимодействия in vivo
- 34. Электрофорез в неденатурирующих условиях Химическая сшивка
- 35. Электрофорез белков в неденатурирующих условиях1. Получение
- 36. Фото-активируемые аналоги аминокислотL-Photo-Leucine и L-Photo-methionine – аналоги
- 37. Химические сшивки белковСОННПростейший способ – «сшить» формальдегидом:
- 38. Химическая сшивка белка с ДНК – иммунопреципитация
- 39. кДНК эукариотический вектор,
- 40. Слайд 40
- 41. Доставка крупных молекул в клеткиМикроинъекция: ДНК, мРНК,
- 42. таг-1таг-2Ко-экспрессияИммунопреципитация антителами против
- 43. Ко-экспрессия возможных партнеров: ко-локализацияПерераспределение зиксина в ответ на экспрессию фактора Xanf-1(from Martynova et al.)
- 44. фрагмент белка А, связывающий иммуноглобулины
- 45. XYXYTEV XYCa2+ EGTA XYанализШаг 1: своим IgG-связывающим
- 46. Скачать презентанцию
Стратегия: от белка к гену Изолировать белок на основе его функциональной активности (например, энзиматической или гормональной) Частично определить последовательность аминокислот Синтезировать олигонуклеотиды, соответствующие определенным последовательностям аминокислот Использовать олигонуклеотиды как пробы
Слайды и текст этой презентации
Слайд 2Стратегия: от белка к гену
Изолировать белок на основе его
функциональной активности
(например, энзиматической или гормональной)
Частично определить последовательность аминокислот
Синтезировать олигонуклеотиды, соответствующие определенным последовательностям аминокислот
Использовать олигонуклеотиды как пробы для отбора из
библиотеки кДНК или геномного клона, кодирующих этот
белок
Определить последовательность нуклеотидов
изолированного клона
Слайд 3Определение
последовательности
аминокислот
с помощью метода
деградации по Эдману
фенилизотиоцианат
гидролиз
Цикл 1
Цикл 2
Идентификация
аминокислотных остатков
гидролиз
Слайд 4Стратегия: от гена к белку
Изолировать геномный клон, соответствующий измененному
белку в
мутанте (например, ауксотрофия, наследственные болезни, дефект
развития)Использовать геномную ДНК для изолирования кДНК, кодирующей
этот ген
Определить последовательность нуклеотидов изолированной кДНК для выведения последовательности аминокислот кодируемого ею белка
Сравнить выведенную последовательность аминокислот с
последовательностью нормального белка
Использовать экспрессионный вектор для получения мутантного
белка
Слайд 5Взаимодействия двух белков
in vivo
in vitro
центрифугирование
хроматография
ко-иммунопреципитация
Blot-overlay
Pull-down
Surface Plasmon Resonance
бесклеточные модельные системы
контролируемые условия
Слайд 6Электрофорез белков в полиакриламидном геле
Определение содержания белка во фракциях
Выделение
белка для последующего анализа
Оценка чистоты препарата
Определение молекулярной массы
SDS
100ºC
SH-реагент
Додецилсульфат натрия (Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) – анионный детергент; его молекулы сообщают любой полипептидной цепи отрицательный заряд, величина которого пропорциональна длине цепи,
поэтому все белки движутся к аноду.
Скорость этого движения обратно пропорциональна логарифму массы молекулы, – хотя плотность заряда одинакова,- молекулы делятся по размеру из-за тормозящего действия геля.
SH
S
SH
S
Слайд 7 Двумерный электрофорез
–
максимальное разрешение белков в геле
-
-+
+
без SDS, но в мочевине
деление по заряду молекулы
в присутствии SDS,
деление по молекулярной массе
градиент рН
-
+
первое направление,
амфолины
второе направление
300-900 Д
Слайд 8 10 мкг белка
14С-метка
825 часов
экспозиции
1100 белков
E. сoli, разделенные с помощью
двумерного электрофореза
(P. O’Farrell, 1974)
Слайд 9Окрашивание белков в геле и на мембране
SDS-гель
перенос на
мембрану
Ag (0,1-1 ng)
Coomassie
(1-2 мкг)
Cu++
элюция
из геля
масс-спектрометрия
Ponceau S
иммуноокрашивание
идентификация
+
Слайд 10 Масс-спектрометрия MALDI-TOF
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
- Time Of Flight
UV лазер (330-360 nm )
катод
анод
сигнал
образец и
матрица
ускорение разность
потенциалов
вакуум
детектор
Принципиальная схема устройства масс-спектрометра
дрейф
Слайд 11белковое пятно вырезают из геля
белок переваривают трипсином; смесь пептидов
вносят
в масс-спектрометр и получают спектр
количество
отношение масса/заряд
MALDI-TOF
поиск в базе белковых последовательностей
совпадения с теоретическимимассами, рассчитанными для всех триптических пептидных продуктов
идентификация белка и изолирование соответствующего гена
Слайд 12отдельный пик белка,
очищенного хроматографией
пептиды, полученные обработкой
очищенного белка трипсином
первый
масс-спектр дает
массы пептидов
каждый пептид дальше фрагментируется
по пептидным связям
массы фрагментов
для каждого пептида определяются на втором масс-спектре
количество
отношение масса/заряд
разница в массах между фрагментами
позволяет составить последовательность
пептида
Слайд 13Центрифугирование: угловой ротор
сила гравитации в
ультрацентрифуге
Fs=mω r
супернатант
осадок
Type 45 Ti
6 x 94
mL
20 x 0.2 mL
TLA-100
сила трения
Архимедова сила
2
Слайд 14градиент плотности
отверстие
частицы возрастающей плотности
сила гравитации
TLS-55
4 x 2.2
mL
6 x 39 mL
SW 28
Центрифугирование: бакет (bucket) -ротор
сила трения
Плавучая плотность
в CsCl, г/смДНК: 1,69-1,73, (в воде 1,1, собственная ок.2)
РНК: более 1,9
Белки: 1,30-1,33
3
Слайд 15 Аналитическое ультрацентрифугирование
S – константа седиментации
(сек)
10 сек = 1 S (Svedberg)
-13
постоянная
скорость
сила трения
Архимедова
силасила гравитации
S20,W - коэффициент седиментации
o
o
70S=30S+50S рибосомы прокариот
80S=40S+60S рибосомы эукариот
Fs + Fb + Ff = 0
Слайд 16Дифференциальное осаждение
гомогенат
целые клетки
ядра
элементы цитоскелета
митохондрии
лизосомы
хлоропласты
пероксисомы
микросомы
мелкие везикулырибосомы
вирусы
цитозоль
Предосторожности при лизисе клеток:
Температура
рН
Ингибиторы протеаз, фосфатаз, киназ
Детергенты?
1000 х g 10 мин.
10000 x g
10 мин.
80000 x g
60 мин.
150000 x g
3 часа
Размеры субклеточных структур
Фракции в виде осадков
Слайд 17Наиболее популярные детергенты
неионные
ионные
Triton X-100
Octylglucoside
(-)Sodium Deoxycholate
(-)Sodium Dodecylsulfate
(+)Цетавлон = Cetyltrimethylammonium bromide
Слайд 18Детергенты растворяют гидрофобные белки
детергентно-липидные
мицеллы
Детергент
Детергентно-белковые
мицеллы
Детергентные
мицеллы
Фрагментация
Липидно-белковая
мембрана
ККМ - критическая концентрация
мицеллообразования
> ККМ
амфифильность
(гидрофильные и
гидрофобные области)
детергент
мембрана
Слайд 19Центрифугирование в градиенте плотности
Седиментация:
непрерывный линейный градиент
формируется в процессе центрифугирования
Плавучая
плотность ДНК в градиенте CsCl
Седиментация:
непрерывный линейный градиент,
сформированный заранее
Например,
градиент сахарозы (органеллы) Седиментация:
ступенчатый градиент,
сформированный заранее
Флотация:
ступенчатый градиент,
сформированный заранее
Слайд 20Анализ фракций градиента
номера фракций
OD280
концентрация сахарозы
Концентрация сахарозы
Концентрация белка
Энзиматическая активность
Белковый состав фракций
Распределение
интересующего
белка
иммуноблоттинг
Слайд 21Пример: флотация микротрубочек
(from Fuchs and Westermann)
1
3
5
смесь митохондрий
и микротрубочек
Anti-Nkin2
Предварительная инкубация митохондрий
с антителами против белка Nkin2 семейства кинезина
из N.crassa лишает их способности «поднимать» микротрубочки. Остальные антитела не влияют.Вопрос: какой из белков на поверхности митохондрий опосредует их связывание с микротрубочками?
Слайд 22Гель-фильтрация
Аффинная хроматография
Ионообменная хроматография
Виды хроматографии
антитело
пористая гранула
заряженная гранула
Na+
Cl-
DEAE-группа
CM-группа
Na+-форма; щелочные белки
OH- или Cl--формы
Слайд 23Pull-down анализ: связывание с рекомбинантным белком,
в бактериях
аффинный
домен
аффинный
домен
N
C
бактериальный
лизат
клеточный
экстракт
элюция
глютатионом
Глютатион-S-трансфераза + глютатион
Белок, связывающий мальтозу + мальтоза
6 остатков гистидина + ионы Ni2+
=
глютатион-агароза
Слайд 24 Ко-иммунопреципитация:
нужны антитела к обоим партнерам
bead
А
А
А
А
центрифугирование
и промывание
bead
А
А
А
А
инкубация с
анти-
иммуноблоттинг с анти-
Образуют ли комплекс белки и
?
Слайд 25Пример: взаимодействие двух секретируемых белков
ДНК, кодирующая FLAG-белок А
ДНК, кодирующая Myc-белок
В
Иммунопреципитация антителами к FLAG
Иммуноблоттинг преципитата с антителами к Myc
Слайд 26белки разделяются электрофорезом и переносятся из геля на мембрану
инкубация с
белком-«наживкой»
инкубация с антителами против белка-«наживки»
инкубация со вторичными антителами
проявление
Blot-overlay анализ
сравнение с
гелем
Слайд 27 Surface Plasmon Resonance: анализ взаимодействия очищенных белков или белков
и нуклеиновых кислот
призма
лазер
камера
поляризатор
слой золота
партнер
буфер
Слайд 29
Быстрая идентификация продукта гена
Локализация мутаций посредством
синтеза укороченных продуктов
Включение модифицированных
неприродных аминокислот
для структурных исследований
Исследование сворачивания белка
Изучение влияния разных факторов
на транскрипцию и трансляцию
Биохимическая in vitro система: синтез белка
Слайд 30Обычно используемые системы
1. Экстракт ретикулоцитов кролика.
Ретикулоцит – предшественник
эритроцита, он уже не имеет ядра.
Много эндогенной
мРНК, но она в основном глобиновая: 90% синтезируемого белка – глобин. Синтез глобина можно использовать
как модель для изучения роли разных факторов в процессах
транскрипции и трансляции. В сопряженной системе используется
фаговая РНК-полимераза.
2. Экстракт зародышей пшеницы. Низкое содержание эндогенной мРНК.
3. Экстракт E. coli. Содержит все, что нужно для транскрипции и
трансляции. Синтез белка идет существенно быстрее, чем в
«эукариотических» системах. Собственные мРНК нужно удалять.
Слайд 31Пример: синтез люциферазы светлячка
в
бесклеточной системе
Вопрос: происходит ли при синтезе в бесклеточной системе E.
coli образование на рибосоме активной конформации каждого из двух пептидов, различающихся по длине их С-концевых участков? мРНК люциферазы была лишена стоп-кодона, поэтому пептиды оставались связанными с рибосомами.
Пуромицин имитирует аминоацил-тРНК; на него «перебрасывается» С-конец растущего
пептида, высвобождается пептидил-пуромицин, синтез белка прекращается.
Слайд 32Черные столбики – активность люциферазы
Серые столбики – активность люциферазы
после добавления пуромицина
(from Kolb V. et al.)
оптическая плотность при
280 нмактивность люциферазы
номера фракций
номера фракций
Результат центрифугирования
в градиенте концентрации сахарозы
а)
б)
а) «растущая» люцифераза без удлинения С-конца
б) «растущая» люцифераза, удлинённая на 59 аминокислот с С-конца
Слайд 34 Электрофорез в неденатурирующих условиях
Химическая сшивка
Иммунопреципитация хроматина
Колокализация в
клетке
Pull-down из клеточного лизата
Дигибридная дрожжевая система
Fluorescence Resonance
Transfer Energy- FRETTandem Affinity Purification
С какими молекулами взаимодействует данный
белок in vivo?
Взаимодействуют ли два (три и т.д.) данных
белка в клетке?
С какой последовательностью ДНК взаимодействует данный белок?
Слайд 35 Электрофорез белков в неденатурирующих условиях
1. Получение белка в очищенном
нативном виде
2. Определение свойств выделенного белка:
Изменение заряда вследствие химической
модификации или деградации
Модифицированные конформации –
неправильно свернутые, частично
денатурированные…
Олигомеры и агрегаты (как ковалентно,
так и нековалентно связанные)
Взаимодействие белков между собой
или с лигандами
Свойства ПААГ
мембранные белковые
комплексы митохондрий
10 kDa - 10 MDa
(from I. Wittig et al.)
АТФ-синтазная
активность F1, проявленная
непосредственно
в геле (фосфат
свинца в осадке)
0,002% Coomassie G-250 в катодном буфере
рН 7,5
нитрат свинца,
АТФ
Слайд 36Фото-активируемые аналоги аминокислот
L-Photo-Leucine и L-Photo-methionine –
аналоги нормальных аминокислот;
присутствуя в
среде, они включаются
в белки в процессе обычной трансляции
Химическая
сшивка белков посредством фотоактивациирост в среде с
Photo-Leu и
Photo-Met
UV
365 нм
лизис клеток
-
+
результат
сшивки
масс-спектрометрия
гель-хроматография
электрофорез
Слайд 37Химические сшивки белков
С
О
Н
Н
Простейший способ – «сшить» формальдегидом:
в водной среде
НО
СН2
ОН
белок
белок
СН2
метиленгликоль
Преимущество: cвязывание ковалентно, но обратимо при нагревании,
поэтому возможен анализ
с помощью электрофореза и иммуноблоттинга,а также последующей масс-спектрометрии
связывание по близким
аминогруппам
Недостаток: нет специфичности в отношении белков, поэтому
белки связываются с нуклеиновыми кислотами, углеводами и т.д.
Слайд 38Химическая сшивка белка с ДНК –
иммунопреципитация хроматина:
идентификация на ДНК
сайта связывания белка
Х
химически сшиваем белок с ДНК
ДНК
регуляторный белок
лизируем клетки
и ядранарезаем ДНК на короткие фрагменты
выделяем регуляторный белок и ассоциированный
фрагмент ДНК иммунопреципитацией
Х
Х
удаляем белок, амплифицируем выделенный фрагмент ДНК в PCR и определяем в нем последовательность нуклеотидов
Слайд 39кДНК
эукариотический вектор,
кодирующий белок
+
таг или репортер
клонирование
экспрессия
Экспрессия трансгена в клетках эукариот
локализация белка
выделение
белкатрансфекция
белок, меченный тагом или
слитый с флуоресцентным белком
Слайд 41Доставка крупных молекул в клетки
Микроинъекция: ДНК, мРНК, белок
Липосомная трансфекция:
ДНК, мРНК
Са-фосфатная трансфекция: ДНК
Электропорация: ДНК, мРНК, белок
Вирусная инфекция: ДНК Фагоцитоз
Слайд 42таг-1
таг-2
Ко-экспрессия
Иммунопреципитация
антителами против
тага-1
Иммуноблоттинг преципитата
с
антителами против тага-2
Ко-экспрессия возможных партнеров:
использование клетки как пробирки
Слайд 43Ко-экспрессия возможных партнеров:
ко-локализация
Перераспределение зиксина в ответ на экспрессию фактора
Xanf-1
(from Martynova et al.)
Слайд 44фрагмент белка А,
связывающий
иммуноглобулины
белок, специфически
связывающий
калмодулин
в присутствии ионов Са2+
В клетке:
клеточный экстракт,
содержащий комплекс
белка Х и некоего партнера
Tandem Affinity Purification
Х
Y
X
Экспрессия в клетках млекопитающих интересующего белка
в виде fusion с двумя аффинными доменами:
участок расщепления
специфической
вирусной протеазой TEV
интересующий нас
белок Х
Слайд 45X
Y
X
Y
TEV
X
Y
Ca2+
EGTA
X
Y
анализ
Шаг 1: своим IgG-связывающим
доменом комплекс связывается
с иммуноглобулинами,
иммобилизованными на колонке 1.
Шаг 2: протеаза TEV
отщепляеткомплекс от этого домена.
Шаг 3: в присутствии ионов
Са++ комплекс связывается с
калмодулином,
иммобилизованным
на колонке 2.
Шаг 4: Хелатор Са++ ЭГТА
снимает комплекс с колонки.
Условие: комплекс YX должен сохраняться в присутствии Са2+
