Методы определения микробной биомассы в почве И.В. Евдокимов

взаимосвязей между структурой и функциями микробного сообщества
Функционирование ризосферы и дриллосферы

как гологеномов

Роль микробиоты в регуляции потоков парниковых газов и, таким образом, в глобальных изменениях климата

Определение запасов и потоков биофильных элементов через микробную биомассу

Определение дыхательной и ферментативной активности микробного сообщества

Определение структуры микробного сообщества

I. Методы, основанные на анализе биомаркеров : PLFA-PLEL (ЖК фосфолипидов),

LPS, гликолипидов, эргостерола, хинонов и др. Анализ ATФ, ДНК и РНК - неспецифических биомаркеров.

II. Биоцидные методы - фумигационный (FI, FE), регидратационный (RI, RE).

III. Методы, основанные на дыхательном отклике микробного сообщества –
субстрат-индуцированного дыхания (СИД, SIR), кинетический ( KSIR).

profiling
Принцип метода:

Метод PLFA основан на анализе жирных кислот

фосфолипидов (ЖКФ), входящих в состав мембран. ЖКФ не входят в состав запасных веществ клетки, а после смерти клетки подвергаются быстрому биохимическому разложению под действием внеклеточных ферментов. Это делает PLFA (ЖКФ) отличными маркерными веществами, а полученные по результатам анализов PLFA (ЖКФ) микробные профили могут быть использованы для качественного и количественного анализа микробного сообщества почвы.

Грам - бактерии
Грам + бактерии
Актиминоцеты
Архебактерии
Простейшие
«Неспецифическая»

информация:
общее кол-во липидов (биомасса)

Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов)

НЕ исчерпывающий) выделяют следующие классы:
SATFA (saturated fatty acids, насыщенные

жирные кислоты)
Как правило, являются маркерами Г+ бактерий.
Исключения:
циклические PLFA (c префиксом Cy)– являются маркерами Г- бактерий;
n14:0, n15:0 - неспецифические (встречаются и у Г+, и у Г-);
Длинноцепочечные (длиннее С20) – маркеры эукариот (простейшие, растения).

Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов)

являются маркерами Г- бактерий.

Исключения:
16:1w5 – маркер для арбускулярных микоризых

грибов;
18:1w9 – маркер для сапротрофных грибов.

Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов)

правило, являются маркерами для сапротрофных грибов.
Наиболее распространенный в почве

маркер для сапротрофных грибов - 18:2w6,9.

Прочие маркеры:
18:1w7 – маркер для метанотрофов;
10Me18:0, 10Me17:0, 10Me16:0 – маркеры для актиномицетов.

Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов)

с целью выявления групп микроорганизмов, ответственных за определенные процессы/последовательности реакций

цикла углерода.
Может быть использован не только для качественного, но и количественного анализа микробной биомассы в почве.
Соотношения между группами PLFA являются хорошими индикаторами стресса в почве.
Недостатки:
Не дает возможности определять микроорганизмы до вида или рода (за исключением актиномицетов).
Необходимость сложных экстракций с токсическими растворителями – по сути дела, это сложный метод органической химии с газохроматографическим окончанием.
Сложность с идентификацией пиков и однозначной привязкой их к стандартам-ЖКФ.

Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов)

determined by PLFA analyses)
Основные индикаторы
Соотношение «грамположительные бактерии/ грамотрицательные

бактерии» (Gram-positive-to-Gram-negative ratio). Соотношение «насыщенные ЖКФ/мононенасыщенные ЖКФ» как аналог данного индекса (SATFA/MUFA ratio as an analogue of that index).
Соотношение trans/cis изомеров (напр., 16:1w7t/16:1w7).

Соотношение «циклические ЖКФ/их моноеновые предшественники» (cyclopropyl PLFA to monoenoic precursors ratio) – напр., в парах cy17:0/16:1w7 и cy19:0/18:1w7.

Вспомогательные индикаторы:
Относительное обилие тех или иных специфических ЖКФ – маркеров микромицетов, бактерий, простейших и т.д. (abundance of specific PLFA – markers of fungi, bacteria, protozoa etc). Соотношение «грибы/бактерии» (fungi/bacteria ratio).

Германия

Германия

– 4 :

- 8 (II) :

с дальнейшим определением концентрации ДНК (III) :
Полимеразная цепная реакция, ПЦР

(PCR)

24 ч (чаще всего, хлороформа CHCl3 ), а биомасса микроорганизмов,

убитых этой биоцидной обработкой, определяется по приросту (flush) в выделении СО2 при последующей инкубации почвы - метод фумигации инкубации, fumigation-incubation (FI) (Jenkinson & Powlson, 1976), либо по приросту (flush) растворимых соединений углерода (в других вариантах - азота, фосфора или серы) – метод фумигации-экстракции, fumigation-extraction (FE) (Brookes et al., 1985).

20 – 40 г в пересчете на абс.сух.) помещают в

эксикатор, дно которого выстелено фильтровальной бумагой, смоченной в воде. В эксикатор ставят стаканчик с хлороформом, на дно стакана кладут стеклянные бусы для предотвращения образования слишком больших пузырьков хлороформа.
Закрывают эксикатор крышкой, подсоединяют вакуумный насос и вакуумируют до появления пузырьков хлороформа в стаканчике. Желательно, чтобы кипение продолжалось не менее 2 мин.
Отсоединяют насос, изолируют атмосферу внутри эксикатора от внешней атмосферы, оставляют эксикатор в темноте при комнатной температуре на 24 часа.
Открывают эксикатор, удаляют стаканчик с остатками хлороформа. Затем подсоединяют насос и вакуумируют систему в течение нескольких минут, затем открывают краны, заполняя эксикатор обычным воздухом. Повторяют процедуру 4 – 5 раз с целью удаления остатков фумиганта в почве. Вынимают емкости с почвой из эксикатора.

– 0,5 М растворе K2SO4) из почвы, подвергшейся фумигации, анализируют

содержание растворимого С (N, P или S).
Из полученных величин С (N, P или S) в растворе (FE) или выделившемся СО2 (FI) вычитают соответствующие величины, определенные в контрольной почве. Контролем служит свежая почва, не подвергшаяся фумигации.
Рассчитывают величину биомассы по формуле
Cbio = (Fc-Ufc) / kc = flushC / kc
(или по аналогичным формулам для других биофильных элементов),
где Fc – С в фумигированной почве, Ufc – С в контроле, kc – пересчетный коэффициент (conversion factor), flush C – прирост («флаш») растворимого или минерализуемого углерода.

Нойерберг/Мюнхен, Германия
Университет г. Гёттинген, Германия

фумигации-экстракции и фумигации-инкубации:

Замена процедуры экспозиции в парах хлороформа на

экстракцию с эмульсией хлороформа в растворе K2SO4.

Длительность экспозиции 1 ч.
Дозировка хлороформа – 1мл/10 г почвы (возд.-сух вес).
Применяется для анализа С,N и P микробной биомассы в почве.

экстракции» по сравнению с другими вариантами фумигационного метода:

Отсутствие довольно утомительной

и опасной процедуры вакуумирования эксикатора.

Не нужен специальный вакуумный насос, стойкий к органическим растворителям (экономия средств).

Экономия времени при проведении анализов: не нужно тратить сутки на экспозицию; не нужно многократно вакуумировать эксикатор по окончании экспозиции с целью избавления от остаточных концентраций хлороформа в растворе.

фумигационном методе) заменяется на высушивание почвы при 65 – 70оС

в течение 24 ч. По окончании высушивания прирост (flush) в С и N, вызванный поступлением в почву убитой биомассы микроорганизмов, определяется аналогично методу фумигации-экстракции (FE), или после добавления воды – как в методе фумигации-инкубации (FI) (Благодатский и др., 1987).

использовать токсические вещества (фумиганты).

Меньшая трудоемкость, отсутствие манипуляций

с вакуумным эксикатором.

Возможность хранить высушенные пробы длительное время, «накапливая» их для экстракции и анализа на С и N.

Недостатки метода по сравнению с фумигационным:
Большее количество растворенных органических веществ в экстракте, имеющих немикробное происхождение (собственно ПОВ становится более растворимым в результате высушивания).

Нет взаимозаменяемости экстрактов K2SO4 и CaCl2, которая бывает у образцов многих сельскохозяйственных почв при использовании метода FE.

Отсутствие апробации метода на широком ряде почв и экологических условий – этот метод не является «стандартным», общепризнанным методом.

результатами прямого микроскопирования (Jenkinson & Powlson, 1976).

По результатам определения С

или N в биомассе микроорганизмов, выращенных на искусственных средах (Van Veen et al., 1987) - «непрямой метод».

Для kEN – расчет по усредненному значению С:N во “flush” после фумигации (Joergensen & Mueller, 1996) - «непрямой метод».

с внесением 13C или 14C меченого С субстрата (при определении

kEC) или 15N меченого источника N (при определении kEN) (Brookes et al., 1985; Jenkinson, 1988; Blagodatsky & Yevdokimov, 1998).

Большинство исследователей выбирает простой путь – берут наиболее часто встречающиеся в литературе величины kEC = 0,45 и kEN = 0,54 и считают величины пересчетных коэффициентов постоянными.
Это – главный источник ошибок при применении биоцидных методов!!!

с изотопами с широким интервалом величин C:N во вносимом субстрате,

либо с широком интервалом величин других факторов (рН, почвенная влажность и т.д.) При этом появляется возможность получить эмпирические уравнения зависимости k от вышеперечисленных экофизиологических факторов.

эмпирических уравнений:
kEC = 0,2(C/N)0,3
C:N в калибровочном эксперименте колебалось от 3,4

до 36,2, при этом kEC варьировали от 0.18 (при максимальной величине C:N) до 0,62 (при минимальной) (Yevdokimov et al., 2006).
kEN = (4,7 (1 – kEC) + (C/N) kEC) kEC/(C/N) (Blagodatsky & Yevdokimov, 1998).
Общая закономерность: чем выше соотношение C:N, тем ниже пересчетный коэффициент.

определить сорбцию Р-содержащих соединений.

Необходимо количественно определить изотопный обмен при определении

пересчетного коэффициента в опытах с радиоактивной меткой азота (32Р и 33Р).


В связи с этим перспективным представляется использование анионно-обменных смол (anion-exchange membranes, AEM).

33P
Для всех типов почв можно использовать
0.9 для
Rsorp и

Rexch

Мечение изотопом 33P

Экспериментальное определение коэффициента сорбции Rsorp

Экспериментальное определение коэффициента изотопного обмена
Rexch

Экспериментальное определение пересчетного коэффициента kP на основе Rsorp
и Rexch

Ионообменные мембраны показали гораздо более высокое сродство
к фосфатам, чем поверхность почвенных частиц,
поэтому…

kP показал сильную специфичность для каждой почвы, вероятно, из-за колебаний соотн. «грибы:бактерии», поэтому…

определенные по тесту Тьюки (n=3).
Результаты. Извлекаемость 33P после сорбции и

изотопного обмена во время ионообменной процедуры (%); пересчетные коэффициенты для расчета микробного P (+ SE)

Yevdokimov et al., 2016

микробной биомассы
Semenov et al. (2017) :
Cмик (мкг/г почвы) = FDNA

× dsDNA (мкг/г почвы),
где FDNA – пересчетный коэффициент. Величины пересчетного коэффициента составили:

FDNA = 4,4 – при калибровке по методу фумигации-экстракции (FE)
FDNA = 5,1 – при калибровке по методу СИД (SIR)

Joergensen (2006) :
Cмик (мкг/г почвы) = FPLFA × PLFA (нмоль/г почвы),
где FDNA – пересчетный коэффициент. Величины пересчетного коэффициента составили:

FPLFA = 5,8 – при калибровке по методу фумигации-экстракции (FE)
FDNA = 6,0 – “ – “ -

почву вносят глюкозу и определяют дыхательный отклик микробного сообщества на

внесение легкодоступного субстрата, продолжающийся в течение первых 3 - 4 ч (Anderson & Domsch, 1978). Углерод микробной биомассы рассчитывается с использованием пересчетного коэффициента.

40 г вносят раствор глюкозы или сухую глюкозу, перемешанную с

тальком, прокаленным песком или др. инертным веществом. Почву, обогащенную углеродным субстратом, помещают в сосуд/ пластиковую трубку, герметично изолированную от окружающей атмосферы эластичной крышкой или мембраной, и инкубируют в течение нескольких часов в термостатических условиях.
Производят периодическое (каждые 0,5 – 1 ч) определение скорости выделения СО2 из почвы (почвенного дыхания).
Рассчитывают углерод микробной биомассы y (мкг С/ г) по следующей формуле:
y = 40,04x + 0,37 ,
где x – интенсивность дыхания (мкл СO2/( г * ч)) – Anderson & Domsch (1978).

Метод СИД (SIR)

хроматографе - gas chromatograph, GC (вручную или с автоматизированной системой

пробоотбора и измерений).
Методом инфракрасной спектроскопии –анализ производится на инфракрасном газовом анализаторе – infrared gas analyzer (IRGA) (вручную или с автоматизированной системой пробоотбора и измерений). .
Адсорбционным методом - почва помещается в пластиковые стаканчики, стаканчики герметически изолируют в микрокосме с емкостью, содержащей раствор КОН. Измерения проводимости раствора щелочи производятся автоматически через заранее установленные интервалы времени. Уменьшение проводимости пропорционально поглощению СО2 из атмосферы микрокосма.

Метод СИД (SIR)

нужно использовать токсические вещества (фумиганты), не нужно производить измерения растворимых

соединений С и N.

Меньшая трудоемкость при использовании автоматической установки с IRGA или RESPICOND, возможность использовать большее число повторностей.

Возможность определять микробную биомассу параллельно с базальным дыханием на той же установке.

Недостатки СИД по сравнению с биоцидными методами

Нельзя определить N, P и S в микробной биомассе.

Нельзя определить изотопный состав микробной биомассы.

для расчетов, в которых величина х уже приведена к размерности

мкг СО2-С/(г * ч). В этом случае происходит занижение расчетной величины микробной биомассы почти вдвое: фактически нужно подставлять пересчетный коэффициент 56.

SIR:
В ряде публикаций величины микробной биомассы, полученные методом СИД (SIR),

оказывались ниже таковых, полученных фумигационным или регидратационным методами. Это – следствие несовершенства методик определения пересчетных коэффициентов!

На этом основании, а также в связи с тем, что в методе СИД (SIR) определяется дыхательная активность микробного сообщества, некоторые авторы до сих пор утверждают, что метод СИД (SIR) определяет «активную микробную биомассу». Это – ошибка!!! И биоцидные методы, и СИД (SIR) предназначены и откалиброваны для определения одного и того же пула – общей микробной биомассы.

почве :
Определение пересчетного коэффициента !!!

почву вносят глюкозу и определяют динамику выделения СО2 в течение

16 – 24 ч после внесения легкодоступного субстрата (Panikov & Sizova, 1996). Общая и активная микробная биомасса, а также удельная скорость роста рассчитываются с использованием уравнений экспоненциального роста. Определения скорости выделения СО2 производятся в динамике (оптимально – не реже 1 раза в час) аналогично тому, как это делается в методе СИД (SIR).

µmax – максимальная удельная скорость роста
Кинетический метод – kinetics

of substrate-induced response (KSIR)

Определяемые параметры:

Уравнения:

v(t) = vu + vc ×exp(µmax×t) (1), где v(t) – скорость продукции CO2; t - время

(Panikov & Sizova, 1996)

)

r0 – фракция «активной» микробной биомассы

r0= (vC ×0.1)/( vU + vC ×0.1) (2)

x0 - общая микробная биомасса

x0=(vC × 0.9 × Yx/p)/(r0 × µmax) (3),
где Yx/p– экономический коэффициент

x’ = x0 × r0 (4)

x’ – «активная» микробная биомасса

другими методами определения микробной биомассы
Определение не только общей, но

и активной микробной биомассы.
Определение параметров микробной кинетики, что особенно важно при моделировании микробного роста в почве.
Большая чувствительность по сравнению с СИД при определении быстрой динамики микробной биомассы в почве и ризосфере.
Не требуется дополнительных лабораторных манипуляций по сравнению с СИД – кинетику выделения СО2 можно изучать в тех же пробах.

Недостатки KSIR по сравнению с другими методами определения микробной биомассы
Привлечение довольно сложного математического аппарата, высокая трудоемкость расчетов.
Параметры µmax и vc часто бывают скоррелированными между собой – результаты расчетов микробной биомассы поэтому получаются не свободными от субъективизма исследователя.
Использование фиксированных значений коэффициента CN-резистентного дыхания и экономического коэффициента Y.
Отсутствие апробации на широком ряде почв и экосистем.

и кинетический (KSIR)
Технический Университет г. Инсбрук, Австрия

кинетический (KSIR)
Институт почвенной экологии,
Научн.-иссл. центр Гельмгольцевского общества, Нойерберг/Мюнхен, Германия

измерений внутрисуточной динамики
Высокая степень автоматизации измерений
Определение таксономической структуры микробного

сообщества

БИОЦИДНЫЕ МЕТОДЫ

Возможности метода

Фумигационный метод

Регидратационный метод

Название метода

Принцип получения аналитического сигнала

БИОЦИДНЫЕ МЕТОДЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНОГО ОТКЛИКА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАРКЕРОВ

СИД

Метод СИД

СИД

Кинетический
метод

АТФ

ЖКФ

ДНК и РНК

Низкая трудоемкость определений

// Russian Journal of Ecosystem Ecology. 2018. Т. 3. №

3. С. 1-20. DOI: 10.21685/2500-0578-2018-3-5, Q4.