Основы биосигнализации: Са 2+ / ФОСФОИНОЗИТО-ЛОВАЯ СИСТЕМА МЕССЕНДЖЕРОВ ЛЕКЦИЯ 7

GPCR
(рецепторы, сопряженные с G-белком)
или cемиспиральные рецепторы
1. Внутриклеточный
сигнальный путь,

опосредуемый цАМФ
[c участием Gas / Gai типов
a-субъдиницы гетеро-
тримерного G-белка]

2. Внутриклеточный
сигнальный путь,
опосредуемый
Са2+ / Фосфоинозитолом
[c участием Gaq типа
a-субъдиницы гетеро-
тримерного G-белка]

плазматической
мембраной: специфический
субстрат фосфатидилинози-
толбисфосфат (ФИФ2)
Точки действия различных типов
фосфолипаз

(ФЛаз)

Активация Gaq – субъединицы G-белка
(замена ГДФ на ГТФ в нуклеотид-связы-
вающем центре)

с участием липид модифицирующих ферментов (связаных с
мембраной) из инозитолфосфата

(ИФ) образуются:
1. Вторичные мессенджеры липидной природы (ДАГ и ИФ3):
образуются с участием ФЛазы С b.
2. Другие биоактивные производные, фосфорилированные в
позиции-3 по инозитолу, не являются вторичными мессенджерами.
Образуются с участием фосфатидилинозитол-3-киназы (PI-3K,
ФИ-3К).

Эти ферменты активируются в результате стимуляции соответ-
ствующих мембранных рецепторов: ФЛазы С b посредством GPCR;
ФИ-3К – посредством рецепторов с тирозинкиназной активностью.

Инозитолфосфат (ИФ) – «прародитель» всех этих производных и
вторичных мессенджеров (ДАГ и ИФ3).

листок
мемранного бислоя

плазматической мембраны. Его инозитольное кольцо проеци-ровано в сторону цитозоля. С3,

С4 и С5-атомы инозитольного кольца могут быть фосфорилированы липидными киназами (на-пример, ФИ-3К).

ФИ-3-киназа активируется в мембране посредством рецептора с тирозинкиназной активностью (РТК). В результате, один из SH2-доменов регуляторной субъединицы киназы связывается с фос-фотирозином на цитозольном домене рецептора.
Каталитическая субъединица ФИ-3К фосфорилирует PI(4,5)P2 с образованием продукта - PI(3,4,5)P3. Так создаются временные докинг-участки для различных белков, содержащих РН-домены.
PI(3,4,5)P3 приобретают способность связывать белки, содер-жащие РН-домен. Один из таких белков – серин-треониновая кина-за – ПКВ или Akt. Активное состояние ПКВ/Akt – принципиально важно для обеспечение проведения сигналов, необходимых для выживания клетки (для противодействя апоптозу).

ФЛаза С b удерживается на внутренней поверхности плазматической
мембраны

благодаря наличию у неё РН-домена, взаимодействующего с
ФИ-1,4,5-Ф3.

мессенджер: инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ3). Гидрофилен благодаря –q, которые сообщают ему три

фосфо-рильные группы. Переходит в цитоплазму клетки и взаимодейст-вует с Са2+-каналами в мембране ЭР (ИФ3-рецептор, ассоцииро-ванный с Са2+-каналом), стимулируя выброс Са2+ в цитоплазму. Увеличение концентрации Са2+ способствует активации серин-треониновой протеинкиназы С (ПКС).
Для поддержания кальциевого гомеостаза избыток Са2+ уда-ляется. ИФ3 дефосфорилируется цитозольными специфически-ми фосфатазами и отделяется от Са2+-каналов. Каналы закрыва-ются.

чего остается во внутреннем слое клеточной мембраны. Благодаря латеральной диффузии,

ДАГ встречается с неактивной серин-треониновой ПКС, которая рекрутируется во внутренний слой мембраны из цитолазмы. ДАГ - единственный естественный активатор ПКС.
Повышенная концентрация Са2+ в цитоплазме приводит к свя-зыванию ионов с регуляторными субъединицами ПКС. Это сооб-щает молекуле фермента +q, что позволяет ПКС связываться с несущими –q головками ФС, выступающими над внутренней поверхностью плазматической мембраны.
Т.о., активация ПКС происходит на внутренней поверхности плазматической мембраны только под воздействием ДАГ в присутствии Са2+ (кооперативность эффектов). Действие ИФ3 и ДАГ являются синергичными – итог: активация ПКС.

массой 77 кДа. Полипептидная цепь включает 670-690 аминокислотных остатков. Состоит

из 2-х компактных доменов:
1. Регуляторный домен – гидрофобен, располагается ближе к N-концу цепи. Тут имеются сайты для связывания Са2+ и ДАГ.
2. Каталитический (киназный) домен - более гидрофилен, находится на С-конце полипептидной цепи.
Для ПКС характерен длительный период активности, кото-рая сохраняется, даже если первоначальный сигнал пропал или снизилась [Ca2+]. Причина – постоянное образование дополни-тельного ДАГ из ФХ с участием ФЛазы С.
ПКС делят на три подсемейства в зависимости от сходства первичной структуры (доменов) и способу активации:
а). Классические формы ПКС (активируются ДАГ и Са2+, нуждается в ФС, активируются форболовыми эфирами). Изоформы: a, b, g.
б). Новые формы ПКС (активируются ДАГ, нуждается в ФС, но независимы от Са2+). Изоформы: d, e, h.
в). Атипичные формы ПКС (нуждается в ФС, но не чувствитель-ны к ДАГ и Са2+). Изоформы: l, t, z, m.

фермента.
Красные полоски – Са2+-связывающие домены.
Синие полоски – области, богатые цистеином.
В

одном типе клетки могут присутствовать разные типы ПКС.

традиционные

новые

атипичные

участвует в связывании фермента с ФС внутреннего слоя

мембраны.
Домены С3 и С4 – каталитические домены.
В отсутствии активирующих киназу стимулов, псевдосубстратный домен
связан с каталитическим доменом – конформация, которая лишает фер-
мент активности.

ПКС участвуют в:
- клеточном делении (модуляция активации Ras-Raf-MAP-сигнального

пути, отвечающего за стимуляцию митозов и пролиферацию клеток);
- секреции;
- экзоцитозе;
- транспорте ионов;
- сокращении гладкой мускулатуры;
- экспрессии генов.

неактивная конформация ПКС

активная конформация ПКС

псевдосубстратный
домен

каталитический
домен

При низких [Ca2+] и в отсутствии ДАГ, киназа нахо-
дится в растворимом состоянии в цитоплазме.
Псевдосубстратный домен связан с субстрат связывающим сайтом. По-
вышение [Ca2+] способствует связыванию с Са2+ и присоединению ПКС к
ФС мембраны. Взаимодействие с ДАГ вызывает диссоциацию псевдо-
субстратного домена, что активирует ПКС. (интрастерическая регуляция)

сигнальный путь, опосредуемый ядерным транскрипционным
фактором kB (NFkB). NFkB присутствет

во всех клетках организма
человека и животных.

NFkB – активирует экспрессию 100 – 300 генов, кодирующих
белки, участвующие в регуляции клеточной пролиферации, апо-
птоза, воспалительной и аутоиммунной реакций и др.
NFkB – гетеродимер (белки р50 и р65). В покоящейся клетке NFkB
находится в цитоплазме в неактивной форме: комплекс
р50 / р65 / IkB (IkB – ингибирующий белок). Под действием ПКС-z
активируется киназа IKK (IκB kinase). IKK фосфорилирует
ингибитор IkB, который сразу же покидает гетеродимер и NFkB
становится активным транскрипционным фактором.
Сигнальный путь, опосредуемый NFkB, срабатывает в течение
считанных минут, поскольку не требует синтеза белка de novo:
транскрипционный фактор всегда присутствует в цитоплазме (в
неактивной форме). Такой срочный ответ необходим для своевре-
менной реакции клетки на воздейстиве патогенного или повре-
ждающего фактора.

и его эфиры (ФЭ) – соединения растительного происхо-ждения.
Наиболее часто используемый

эфир:
форбол-12-миристат-13-ацетат

ФЭ связываются с регуляторным доменом ПКС и активируют её в концентрациях, на 3 порядка меньших, чем ДАГ. Благодаря химической структуре (ксенобиотик), ФЭ разрушаются in vivo чрезвычайно медленно.
В присутствие ФЭ сигнальная система оказывается в перма-нентно включенном состоянии - пролиферация клеток пере-стает быть контролируемой. В этом причина выраженной спо-собность ФЭ провоцировать развитие злокачественных опухо-лей. ФЭ – опухолевые промоторы.

12

13

I путь: Инактивация вторичных мессенджеров
Эффекты ИФ3

прекращаются с помощью фосфатаз, дефосфо-рилирующих это соединение.
ИФ3-5-фосфомоноэстераза
ИФ3 (1,4,5) + Н2О → ИФ2 (1,4) + Рi

Последовательное 3-х этапное дефосфорилирование ИФ3 приво-дит к образованию циклического спирта – инозитола, который м.б. субстратом для синтеза ФИ (фосфатидилинозитола).

Эффекты ДАГ могут быть ограничены двумя механизмами:
а). действие ДАГ-киназы, которая фосфорилирует ДАГ до фос-
фатидной кислоты (ФК):

ДАГ-киназа
ДАГ + АТР → ФК + ADP

(превращение 30% ДАГ)

арахидоновой кислоты:

ДАГ-липаза
ДАГ + Н2О 2-арахидоноил-глицерол + R1-СООН (жирная к-та)

На следующем этапе происходит расщепление 2-арахидоноил-глицерола на арахидоновую кислоту и глицерол.

ФК участвует во многих процессах:
* предшественник синтеза многих липидов;
* локально усиливает кривизну мембраны – участие в эндо- и
экзоцитозе;
* участвует во внутриклеточной сигнализации, рекрутируя из
цитоплазмы некоторые белки (сфингозинкиназу).
Арахидоновая кислота и ее производные формируют отдель-ную группу сигнальных молекул: простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов.

II путь: Дефосфорилирование эффекторного белка протеинки-
назы С. С участием специфических фосфатаз (протеинфосфатаз).