Полимеразная цепная реакция

Содержание

1. Полимеразная цепная реакция
2. ИсторияИскусственный синтез ДНК с использованием праймеров был
3. Основные достоинства ПЦРВысокая чувствительностьВысокая специфичностьПроста в исполненииНет
4. Значение для современной науки и медицины Решение
5. Репликация ДНК in vivoМатричная цепь Новая цепь Новая цепь
6. I. Разделение цепей (денатурация)95°C
7. II. Отжиг праймеровIII. Синтез ДНК (удлинение цепи)Праймер
8. Стадии ПЦРДенатурация (94°C)Обеспечивает разделение нитей ДНКГибридизация (отжиг)
9. Схема ПЦРДенатурацияОтжиг праймеровСинтез1 копия(матрица)2 копии
10. Продукт ПЦРДенатурацияОтжигСинтезПродукты после 1-го цикла реакцииПродукты после 2-го цикла реакции
11. Основные принципы ПЦРАмплификация фрагмента происходит между двумя
12. Слайд 12
13. Основные причины выхода на «плато»истощение субстратов (дНТФ
14. Компоненты реакцииБуфер (Tris-HCl, pH = 8,0-8,8; KCl)MgCl2
15. Ферменты
16. ПраймерыДлина праймеров 18-30 нуклеотидовGC-состав 45-55%, близок к
17. Оптимизация ПЦРТемпературный профиль реакции Временной профиль реакции
18. Подбор температуры отжигаПодбор концентрации ионов магния
19. 10 причин, по которым ПЦР неэффективно Плохой
20. Оценка результатов реакцииЭлектрофорезГибридизация с зондами
21. Разновидности ПЦР ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR)TouchdownМультиплекснаяГнездовая (nested)In situ PCRReverse transcriptase (RT-PCR)Real-time PCR (RT-PCR)
22. Другие методы амплификацииЛигазная цепная реакция (ЛЦР, LCR)NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)
23. Организация технологического процессаКонтаминацияОрганизация лаборатории (рабочих мест) по
24. Слайд 24
25. Скачать презентанцию

ИсторияИскусственный синтез ДНК с использованием праймеров был описан еще в 1971 г. В 1983 г. Kary Mullis предложил метод, обеспечивающий накопление (амплификацию) синтезируемого фрагмента ДНК, получивший название полимеразная цепная реакция (Нобелевская

Главная
Разное
Полимеразная цепная реакция

Слайды и текст этой презентации

Слайд 1Полимеразная цепная реакция
Чуреков Никита Максимович 340

Слайд 2История
Искусственный синтез ДНК с использованием праймеров был описан еще в

1971 г.
В 1983 г. Kary Mullis предложил метод, обеспечивающий

накопление (амплификацию) синтезируемого фрагмента ДНК, получивший название полимеразная цепная реакция (Нобелевская премия по химии 1993 г).
Принцип реакции опубликован в 1985 г

ИсторияИскусственный синтез ДНК с использованием праймеров был описан еще в 1971 г. В 1983 г. Kary Mullis

Слайд 3Основные достоинства ПЦР
Высокая чувствительность
Высокая специфичность
Проста в исполнении
Нет необходимости в выделении

или сложной очистке матричной ДНК
Возможность работы с практически любым биологическим

материалом

Основные достоинства ПЦРВысокая чувствительностьВысокая специфичностьПроста в исполненииНет необходимости в выделении или сложной очистке матричной ДНКВозможность работы с

Слайд 4Значение для современной науки и медицины
Решение самых различных научных

задач
Генотипирование организмов
Диагностика инфекционных заболеваний
Диагностика генетических заболеваний и генетической предрасположенности
Установление родства,

идентификация личности
Анализ древних останков, криминалистика
Детекция ГМО

Значение для современной науки и медицины Решение самых различных научных задачГенотипирование организмовДиагностика инфекционных заболеванийДиагностика генетических заболеваний и

Слайд 5Репликация ДНК in vivo
Матричная цепь
Новая цепь
Новая цепь

Слайд 6I. Разделение цепей (денатурация)
95°C

Слайд 7II. Отжиг праймеров
III. Синтез ДНК (удлинение цепи)
Праймер

Слайд 8Стадии ПЦР
Денатурация (94°C)
Обеспечивает разделение нитей ДНК
Гибридизация (отжиг) праймеров на матрице

(45-65°C)
Формирует структуры узнаваемые ДНК-полимеразой
Синтез (удлинение) цепи (72°C)
Происходит синтез комплементарных цепей

и удваивает число молекул ДНК мишени

Стадии ПЦРДенатурация (94°C)Обеспечивает разделение нитей ДНКГибридизация (отжиг) праймеров на матрице (45-65°C)Формирует структуры узнаваемые ДНК-полимеразойСинтез (удлинение) цепи (72°C)Происходит

Слайд 9Схема ПЦР
Денатурация
Отжиг праймеров
Синтез
1 копия
(матрица)
2 копии

Слайд 10Продукт ПЦР
Денатурация
Отжиг
Синтез
Продукты после 1-го цикла реакции
Продукты после 2-го цикла реакции

Слайд 11Основные принципы ПЦР
Амплификация фрагмента происходит между двумя праймерами
Амплификацию проводят в

течение 30-40 циклов
Каждый цикл состоит из смены температурных режимов
В реакции

используют термостабильные ДНК-полимеразы
За 30 циклов происходит умножение амплифицируемого фрагмента ДНК в 1 000 000 000 раз
Кинетика ПЦР характеризуется выходом на «плато»

Основные принципы ПЦРАмплификация фрагмента происходит между двумя праймерамиАмплификацию проводят в течение 30-40 цикловКаждый цикл состоит из смены

Слайд 12

Слайд 13Основные причины выхода на «плато»
истощение субстратов (дНТФ и праймеров)
падение активности

реактантов (дНТФ и фермента)
накопление ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы
конкуренция за

реактанты неспецифическими продуктами или праймер-димерами
концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.

Основные причины выхода на «плато»истощение субстратов (дНТФ и праймеров)падение активности реактантов (дНТФ и фермента)накопление ингибиторов, включая пирофосфаты

Слайд 14Компоненты реакции
Буфер (Tris-HCl, pH = 8,0-8,8; KCl)
MgCl2 (1-3 mM)
Праймеры (0.4

мкМ каждого)
dNTP (40-200 мкМ каждого)
ДНК-полимераза (1 ед)
Матрица (1 до 1000

нг)

Компоненты реакцииБуфер (Tris-HCl, pH = 8,0-8,8; KCl)MgCl2 (1-3 mM)Праймеры (0.4 мкМ каждого)dNTP (40-200 мкМ каждого)ДНК-полимераза (1 ед)Матрица

Слайд 15Ферменты

Слайд 16Праймеры
Длина праймеров 18-30 нуклеотидов
GC-состав 45-55%, близок к GC-составу матрицы
Разница в

температурах отжига не более 5оС
Не должны формировать шпилек на 3-конце
Не

должны формировать димеры по 3-концам

ПраймерыДлина праймеров 18-30 нуклеотидовGC-состав 45-55%, близок к GC-составу матрицыРазница в температурах отжига не более 5оСНе должны формировать

Слайд 17Оптимизация ПЦР
Температурный профиль реакции
Временной профиль реакции
Состав реакционной смеси

конц. ионов магния
конц. праймеров
конц. полимеразы
добавки

(глицерин, ДМСО, формамид, БСА и др.)

Оптимизация ПЦРТемпературный профиль реакции Временной профиль реакции Состав реакционной смеси конц. ионов магния конц.

Слайд 18Подбор температуры отжига
Подбор концентрации ионов магния

Слайд 1910 причин, по которым ПЦР неэффективно
Плохой дизайн праймеров
Неверная концентрация

праймеров
Слишком много dNTP или деградированные dNTP
Не перемешанный раствор MgCl2
Неверная концентрация

MgCl2
Наличие ингибиторов
Плохое качество минерального масла
Слишком много фермента
Ошибки в программе амплификатора
Недостаток или избыток матрицы

10 причин, по которым ПЦР неэффективно Плохой дизайн праймеровНеверная концентрация праймеровСлишком много dNTP или деградированные dNTPНе перемешанный

Слайд 20Оценка результатов реакции
Электрофорез

Гибридизация с зондами

Слайд 21Разновидности ПЦР
ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR)
Touchdown
Мультиплексная
Гнездовая (nested)
In situ

PCR
Reverse transcriptase (RT-PCR)
Real-time PCR (RT-PCR)

Разновидности ПЦР ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR)TouchdownМультиплекснаяГнездовая (nested)In situ PCRReverse transcriptase (RT-PCR)Real-time PCR (RT-PCR)

Слайд 22Другие методы амплификации
Лигазная цепная реакция (ЛЦР, LCR)
NASBA (nucleic acid sequence-based

amplification)

Слайд 23Организация технологического процесса
Контаминация
Организация лаборатории (рабочих мест) по принципу изолированных рабочих

зон
Раздельное использование оборудования и принадлежностей при работе с чистыми растворами

и растворами, содержащими ДНК или продукты ПЦР
Обязательная постановка в каждом эксперименте отрицательного и положительного контролей
Стоковые растворы разделять на аликвоты и периодически заменять

Организация технологического процессаКонтаминацияОрганизация лаборатории (рабочих мест) по принципу изолированных рабочих зонРаздельное использование оборудования и принадлежностей при работе

Слайд 24

Скачать презентацию

Разделы презентаций

Полимеразная цепная реакция

Содержание

Слайды и текст этой презентации

Слайд 1Полимеразная цепная реакцияЧуреков Никита Максимович 340

Слайд 2ИсторияИскусственный синтез ДНК с использованием праймеров был описан еще в

1971 г. В 1983 г. Kary Mullis предложил метод, обеспечивающий

Слайд 3Основные достоинства ПЦРВысокая чувствительностьВысокая специфичностьПроста в исполненииНет необходимости в выделении

или сложной очистке матричной ДНКВозможность работы с практически любым биологическим

Слайд 4Значение для современной науки и медицины Решение самых различных научных

Слайд 5Репликация ДНК in vivoМатричная цепь Новая цепь Новая цепь

Слайд 6I. Разделение цепей (денатурация)95°C

Слайд 7II. Отжиг праймеровIII. Синтез ДНК (удлинение цепи)Праймер

Слайд 8Стадии ПЦРДенатурация (94°C)Обеспечивает разделение нитей ДНКГибридизация (отжиг) праймеров на матрице

(45-65°C)Формирует структуры узнаваемые ДНК-полимеразойСинтез (удлинение) цепи (72°C)Происходит синтез комплементарных цепей

Слайд 9Схема ПЦРДенатурацияОтжиг праймеровСинтез1 копия(матрица)2 копии

Слайд 10Продукт ПЦРДенатурацияОтжигСинтезПродукты после 1-го цикла реакцииПродукты после 2-го цикла реакции

Слайд 11Основные принципы ПЦРАмплификация фрагмента происходит между двумя праймерамиАмплификацию проводят в

течение 30-40 цикловКаждый цикл состоит из смены температурных режимовВ реакции

Слайд 12

Слайд 13Основные причины выхода на «плато»истощение субстратов (дНТФ и праймеров)падение активности

реактантов (дНТФ и фермента)накопление ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексыконкуренция за

Слайд 14Компоненты реакцииБуфер (Tris-HCl, pH = 8,0-8,8; KCl)MgCl2 (1-3 mM)Праймеры (0.4

мкМ каждого)dNTP (40-200 мкМ каждого)ДНК-полимераза (1 ед)Матрица (1 до 1000

Слайд 15Ферменты

Слайд 16ПраймерыДлина праймеров 18-30 нуклеотидовGC-состав 45-55%, близок к GC-составу матрицыРазница в

температурах отжига не более 5оСНе должны формировать шпилек на 3-концеНе

Слайд 17Оптимизация ПЦРТемпературный профиль реакции Временной профиль реакции Состав реакционной смеси

конц. ионов магния конц. праймеров конц. полимеразы добавки

Слайд 18Подбор температуры отжигаПодбор концентрации ионов магния

Слайд 1910 причин, по которым ПЦР неэффективно Плохой дизайн праймеровНеверная концентрация

праймеровСлишком много dNTP или деградированные dNTPНе перемешанный раствор MgCl2Неверная концентрация

Слайд 20Оценка результатов реакцииЭлектрофорезГибридизация с зондами

Слайд 21Разновидности ПЦР ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR)TouchdownМультиплекснаяГнездовая (nested)In situ

PCRReverse transcriptase (RT-PCR)Real-time PCR (RT-PCR)

Слайд 22Другие методы амплификацииЛигазная цепная реакция (ЛЦР, LCR)NASBA (nucleic acid sequence-based