Получение продуцентов с помощью генной инженерии

позволяющих in vitro перенести генетический материал из одного организма (источника генов) в

другой (реципиент) так, чтобы обеспечить наследование этих генов в новом для них организме.
Одной из главных задач генной инженерии является получение организмов с желаемыми свойствами.

1. Сущность и задачи генной инженерии.

гены  и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим (напр., от

человека или животного - бактериям, растениям и др.). Генетически модифицированные микроорганизмы (трансгенные или рекомбинантные), обладающие сверхпродукцией получены для производства инсулина, соматотропина, интерферона и многих других белков.

1. Сущность и задачи генной инженерии.

элемент, способный к репликации (вектор);
III введение вектора в организм-реципиент;

VI идентификация (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены.
I Выделение нужного (целевого) гена
– один из главных этапов в генетической инженерии. Существует два основных способа получения гена: синтез и выделение из ДНК.

2. Этапы получения генетически модифицированных микр–продуцентов

или праймеры (короткие одноцепочечные фрагменты ДНК - 8-16 нуклеотидов), а

гены синтезируют ферментативным методом с помощью ПЦР.

Ι.1)Синтез гена осуществляется 2-мя путями

Выделяют мРНК соответствующего гена из полирибосом и используют ее в

качестве матрицы для фермента ревертазы.
Метод основан на универсальной способности обратных транскриптаз синтезировать двунитевую ДНК (кДНК) на однонитевых РНК-матрицах.

Ι.1)Синтез гена осуществляется 2-мя путями

библиотек, которые представляют собой совокупность фрагментов геномной ДНК какого-либо организма

или из библиотек кДНК.

Ι.1)Синтез гена осуществляется 2-мя путями

помощи рестриктаз. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и

разрезает ДНК либо внутри сайта, либо в непосредственной близости от него.

Ι. 2) Выделение гена из ДНК клетки с нужными свойствами.

клетки-мишени и тем более начинать функционировать. Для переноса целевого гена

создают специальную конструкцию - вектор, несущий полученный ген и способный встраиваться в геном клетки.

II Встраивание гена в генетический элемент, способный к репликации (вектор).

нескольких рестриктаз, должен обладать определенной емкостью;
вектор должен иметь точку

начала репликации (ori), т.е. автономно реплицироваться, накапливаться в многочисленных копиях в клетке хозяина и сохраняться в дочерних клетках при делении материнской;

II 1. Требования к генетическим векторам:

клетке;
- должен иметь маркерный ген, позволяющий различать гибридные клетки для

эффективной селекции;
- должен быть способным передаваться в клетку соответствующего организма.

II 1. Требования к генетическим векторам:

клонирования. pBR322 создана на основе плазмид природного происхождения, выде- ленных

из E. coli. Эта плазмида несет гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину (ген amp) и тетрациклину (ген tet), а также уникальные сайты для BamHI, Hind III и Sal I в генеТеt

бактерий способны реплицироваться независимо от хромосомы это их главное свойство.

Плазмиды могут быть выделены из клетки и использованы в неповрежденном, нативном состоянии. В векторной плазмиде E.coli pBR322 есть маркерные гены устойчивости к ампициллину и к тетрациклину.

II 2. Характеристика векторов для переноса генетической информации в прокариотические клетки.

тетрациклину. Плазмидные векторы удобны для клонирования небольших фрагментов (до 10

тыс. пар оснований) геномов, т.е. плазмидные векторы обладают небольшой емкостью.

II 2. Характеристика векторов для переноса генетической информации в прокариотические клетки.

(вызывать лизогенизацию).
Бактериофаги широко распространены в природе — их выделяют

из воды, почвы, организмов различных животных и человека. Большинство фагов ДНК-содержащие вирусы, имеют смешанный тип симметрии капсида. Широко используют векторы на основе бактериофагов E.coli - λ и М13.

II 2. Характеристика векторов для переноса генетической информации в прокариотические клетки.

клетках E.coli, и оставляют сайты, предназначенные для проникновения и встраивания

фага в геном клетки хозяина (фаговый вектор должен проникнуть в клетку и встроиться в геном). В эту же область встраивают целевой и маркерные гены. На основе бактериофага λ можно сконструировать векторы емкостью до 25 т.п.н.

II 2. Характеристика векторов для переноса генетической информации в прокариотические клетки.

плазмиды агробактерий (Agrobakterium tumefaciens), а также искусственно сконструированные векторы, способные

реплицироваться как в бактериальных, так и в эукариотических клетках (челночные векторы).

II 3. Характеристика векторов для переноса генетической информации в эукариотические клетки.

специфически разрезает плазмиду в единственном сайте, расположенном в гене устойчивости

к тетрациклину, так что образуется линейная молекула с липкими концами. Такие молекулы смешивают с подготовленным участком ДНК (с нужным геном), содержащим комплементарные липкие концы.

II 4. Создание генетической конструкции.

с указанием участка распознавания и места разреза;
б) фрагменты ДНК

с липкими концами после разрезания ферментом EcoRI. Возможно расщ-е ДНК со сдвигом, при этом одна из нитей выступает на несколько нуклеотидов. «Липкие» концы в силу своей комплементарности вступают во взаимодействие.

Выделение генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз

с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой для сшивания

комплементарных концов нужного гена и вектора.

II 4. Создание генетической конструкции.

устойчивость к тетрациклину из-за этой вставки нарушается, и все рекомбинантные

плазмиды сохраняют устойчивость только к ампициллину.
Таким образом, высевая клетки на среды с антибиотиками, можно отобрать клоны, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК.

II 4. Создание генетической конструкции.

клонирования. pBR322 создана на основе плазмид природного происхождения, выде- ленных

из E. coli. Эта плазмида несет гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину (ген amp) и тетрациклину (ген tet), а также уникальные сайты для BamHI, Hind III и Sal I в генеТеt

клетках.

клетки, она должна либо встроиться в ее ге­ном (интегрироваться в

хромосому) и реплицироваться за ее счет (как лизогенные бактериофаги), либо быть способной к автономной репликации (как плазмиды).

III Введение вектора в организм-реципиент.

полиэтиленгликолем, тепловым ударом или лизоцимом, после чего добавляют к ним

векторные конструкции.
Векторы в бактериальные, грибные, растительные или животные клетки вводят разными путями, в том числе естественными способами, которые широко распространены природе:

III Введение вектора в организм-реципиент.

ДНК от исходного вектора. Ёмкость бактериофага λ до 25 т.п.н.

III Введение вектора в организм-реципиент.
Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетичес кого аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном (интегрироваться в хромосому) и реплицироваться за ее счет (как лизогенные бактериофаги), либо быть способной к автономной репликации (как плазмиды).

одной клетки в другую в виде плазмиды;
б) трансдукция – передача

клетке генетического материала через вирус (эукариотических клеток) или фаг;
в) трансформация – это проникновение фрагментов нативной ДНК через оболочку клетки.

III Введение вектора в организм-реципиент.

после трансформации высевают на питательную среду, содержащую ампициллин, так как

трансформированные и нетрансформированные клетки устойчивы к ампициллину (это позволяет выявить клетки как с «пустым» вектором, так и со «вставкой»).

VI Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены

на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом

перепечатки (делают пересев с точным расположением колоний на среде).
Клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину, поэтому не будут расти на среде с тетрациклином.

VI Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены

В таких условиях могут вырасти только те клетки, в которых

присутствует интактный ген bla - или в составе интактной плазмиды pBR322, или в составе гибридной плазмиды; нетрансформированные клетки чувствительны к ампициллину. Сайт BamHI расположен в гене tet плазмиды pBR322, встраивание в этот ген фрагмента ДНК прерывает кодирующую последовательность, и устойчивость к тетрациклину утрачивается. Т. о., кл, несущие гибридную плазмиду, устойч к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину, а клетки, получившие интактную плазмиду pBR322, несут ген tet и устойчивы как к ампициллину, так и к тетрациклину. На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки.

Идентификация и отбор клеток, которые приобрели нужный ген

условиях вызывает у растений образование опухолей (корончатых галлов) в местах

проникновения бактерии

корончатый галл

Галлообразование на морковном ломтике привитом Agrobacterium tumefaciens.

Agrobacterium tumefaciens

A. tumefaciens; 3 – встраивание Т-ДНК в геном; 4 –

образование опухоли

область), гены �vir-области, обеспечивающие перенос Т-ДНК в растительный геном, а

также гены синтеза

фитогормонов (ауксинов и цито-кининов) и опинов (производных аминокислот).

http://www.biotechnolog.ru/ge/ge12_4_2.png

конъюгации (Tra), область репликации (Ori V) и область вирулентности (Vir).

Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а рядом — в области вирулентности—vir-области.
Т-области ограничены прямыми повторяющи- мися последовательностями по 24—25 п. н., и любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за Т-область и перенесена в растительную клетку.

результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную
Ti-плазмиду,

замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в кл растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий.