Развитие исследований: от гена до функции

imaginative science"
Технология мониторинга экспрессии клеточных геномов
Евгения Чакина

ООО «Аламед»
Официальный дистрибьютор

GE Healthcare Life Sciences

Секвенирование генов, экспрессионный

анализ, сайт-специфический мутагенез и др.

Proteomics

Идентификация и характеризация белков, анализ их модификаций и взаимодействий и др.

Ettan DIGE

DNA Microarray

YFP-H2B in Arabidopsis thaliana protoplasts

антитела
Регуляция
Межмолекулярные взаимодействия/активность
Биофармакология

Этапы:
Пробоподготовка - Очистка белка
Разделение с высоким разрешением

/ Анализ cтруктуры
Анализ функции

смеси
Разделение предварительно очищенного образца методом ВЭЖХ или УльтраВЭЖХ
Определение структуры

методом MS

2D-MS: один белок → определение структуры белка
Фракционирование образца методом 2D-фореза, поиск интересующих белков (DIGE), извлечение единичных пятен – молекул белков
Определение структуры методом MS

каскадов реакций, функций белков, формирования белковых комплексов

Фишинг: смесь белков →

«вылавливание единичной молекулы» → определение структуры
Получение фракций на FPLC
Скрининг фракций на чипе – определение взаимодействующей молекулы
Определение структуры методом MS

Фармацевтические исследования и биотехнология:
Скрининг кандидатов в фармпрепараты и антител для диагностикумов
Персонализированная медицина – определение эффективности и метаболизма лекарственных средств

«входной билет в протеомику»

Технология метода основана на последовательном разделении белковых

образцов в двух направлениях: по изоэлектрической точке и массам молекул.

Модификация метода 2D-электрофореза – технология
2D-DIGE (анализ дифференциально окрашенных гелей)
- существенно сокращает временные и финансовые затраты за счет мультиплексирования
- повышает точность, достоверность и воспроизводимость результатов за счет унифицированных условий эксперимента и использования внутреннего стандарта.

внутри эксперимента (одна краска для пост-окрашивания, требуются повторные эксперименты для

разделения биологических и технических вариаций)
Технология DIGE
Обеспечивает большую точность, воспроизводимость и существенно сокращает трудозатраты и время эксперимента:
Мультиплексирование – несколько образцов анализируются в одном геле
«Безобразно но однообразно» – ошибка оператора будет одинакова для всех образцов в геле
Внутренний стандарт – присутствует во всех гелях в одном эксперименте

(3-цветный)
Традиционный 2-D и 2-D DIGE
Традиционный 2D электрофорез (1-цветный)
8 образцов:
4 геля

(без повторностей) = 4 геля

В режиме реального времени
- Кинетика взаимодействий

клетки
Вирусы/бактерии

г.
Система детекции SPR - BiacoreTM
Сенсорный чип
Программное обеспечение
Микрофлюид/ проточные ячейки

белок
В ячейке сравнения - буфер
Измеряется теплота взаимодействия
Обработанные
данные
Данные
эксперимента
MicroCal™ -

принцип

Ячейка
сравнения

Экспериментальная
ячейка

Шприц

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

kcal/mole of injectant

0

1

2

Molar Ratio

Стехиометрия

Аффинность

Механизм

публикаций
Онкология
Нейробиология
Иммунология
Инфекционные заболевания
Протеомика
Трансдукция сигнала
Разработка вакцин, фармпрепаратов и диагностикумов
Выбор и характеристика

связывающих реагентов
Исследования лекарств и многое другое….

разноплановых данных по одному образцу
Многопараметрический анализ данных

живой клетке: транслокации, активация рецепторов, фазы клеточного цикла
Тестирование воздействия

внешних условий (токсинов, лекарственных средств, ингибиторов, активаторов и пр.) на живую клетку
Слежение за несколькими морфологическими параметрами
Возможность мечения нескольких мишеней

Сложные многопараметрические эксперименты
Мультиплексность
Широкомасштабные скрининговые исследования
Быстрота получения данных
Огромное количество данных по одному образцу
Сохранение изображений и повторные анализы

модули (инкубатор, система дозирования) для прижизненного наблюдения
Программное обеспечение
Для получения, обработки

и хранения HCA данных

Биологический объект
Культуры клеток
Ткани
Организмы

кв. пикс.
137 клеток при 10X увеличении

Широкоформатная камера
4.2 Mp CoolSNAP K4;
2048

x2048 пикс.
7.40мкм кв. пикс.
635 клеток при 10X увеличении

Больше клеток, больше данных, быстрее!!!

для анализа живых клеток
Использование опции 3D/деконволюции
для улучшения качества изображения

сигнала

Анализ дифференцировки стволовых клеток

Клеточный цикл

Органеллы и внутриклеточный транспорт

Функционирование

нейронов

Морфологическое и физиологическое состояние клетки

localization of actin toward podosomes.
Cells stained for DNA (blue),

actin (green) and phospho-src (red).
Courtesy of Evelyn Griffin, Scripps Florida

for actin (green), DNA (blue) and paxillin focal adhesion points

(red). IN Cell 1000 Courtesy of Carmen Laethem, Aerie Pharma

репортеры
(AKT в PM ruffles)
Активация рецептора
(CypHer 5E)
Рост нейритов