Тема : Питание микроорганизмов. Методы выделения чистых культур

количества бактерий.
Методы стерилизации и дезинфекции.

олигобиогенные (К, Na, Cl, S, Mg, Fe, Ca, P)‏
III группа

– микробиогенные (Zn, Mn, Co, Cu, F, Br, I)‏
IV группа – ультрамикробиогенные (B, V, Si, Li, Al, Sn, As, Mo)‏
Факторы роста (основные группы)
1. Аминокислоты
2. Пуриновые и пиримидиновые основания и их производные
3. Липиды
4. Витамины

консистенции различают жидкие (мясопептонный бульон, сахарный бульон), плотные (1-2% мясопептонный

агар, свернутая сыворотка), полужидкие (0, 2-0, 5% мясопептонный агар) питательные среды. Для получения П. с. плотной консистенции к жидкой среде добавляют обычно агар-агар - полисахарид, добываемый из морских водорослей, или желатин - вещество белковой природы животного происхождения.
По составу среды могут быть простыми и сложными
В зависимости от назначения выделяют элективные, среды обогащения, дифференциально-диагностические.

Классификация питательных сред

— плотная среда
Обеспечивают рост большинства бактерий
Служат основой для приготовления сложных

сред

(кровяной, сывороточный, асцит бульон/агар)
Рост гноеродного стрептококка на кровяном агаре(вокруг колоний

видны зоны гемолиза)

(свернутая сыворотка крови с сахарным бульоном) - эффективна для дифтерийной

палочки

для S. aureus

грибов

Эндо, Левина, Плоскирева – используются для выделения чистой культуры энтеробактерий

на 1 этапе; позволяют дифференцировать бактерии, способные и неспособные ферментировать лактозу
Среды Гисса – используются на 3 этапе выделения чистой культуры для определения спектра сахаролитической активности.

мясопептонный агар, лактоза,фуксин,сульфит натрия (Na2SO3),
Принцип действия: фуксин обесцвечивается

сульфитом натрия (образуется бесцветная фуксинсернистая кислота);
Энтеробактерии, сбраживающие лактозу, в процессе брожения выделяют муравьиную кислоту, которая даёт цветную реакцию с реактивами на альдегтды, в том числе и с фуксинсернистой кислотой с образованием свободного фуксина, в результате чего их колонии окрашиваются в малиново-красный цвет с металлическим блеском или без него.
Колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, имеют белый или слабо-розовый цвет (цвет питательной среды).

Среда Эндо

В состав среды Плоскирева входят ингибирующие вещества (желчные соли, бриллиантовый

зеленый, йод), вследствие чего она должна полностью подавлять рост грамположительной флоры, значительно задерживать (первые 24 ч) рост эшерихий и другой сопутствующей микрофлоры, подавлять роение протея.
Дифференцирующие свойства агара Плоскирева основаны на изменении рН в кислую сторону при росте лактозоферментирующих бактерий, которые образуют колонии брусничного цвета (индикатор нейтральный красный).
Лактозоотрицательные бактерии вырастают в виде бесцветных или слабоокрашенных колоний.

кислые продукты меняют рН, при этом изменяется окраска индикатора

Среды Гисса

:

индикатор фенол рот. Посев по поверхности и уколом в столбик

агара. При ферментации только глюкозы – желтый столбик, скошенная часть не меняет окраску. При ферментации и глюкозы, и лактозы (E.coli) – весь агар желтый При образовании сероводорода (сальмонеллы, протей) – агар чернеет

Среда Клиглера:

для определения способности микроорганизмов утилизировать цитраты

смесь различных микроорганизмов, является одним из этапов любого бактериологического исследования,

проводимого с различными целями: диагностики заболеваний, определения микробной обсемененности окружающей среды и т.д.
Для выделения чистой культуры применяют методы, основанные на:
1) механическом разобщении бактериальных клеток (см.метод Дригальского);
2) предварительной обработке исследуемого материала с помощью физических или химических факторов, оказывающих избирательное антибактериальное действие;
3) избирательном подавлении размножения сопутствующей микрофлоры физическими или химическими факторами во время инкубации посевов;
4) способности некоторых бактерий быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопробы)

под микроскопом в окрашенном мазке б) по бактериальному стандарту

(набор эталонов для определения концентрации бактериальных клеток в микробной взвеси по ее мутности; представляет собой запаянные пробирки, содержащие водную взвесь мелких частиц стекла пирекс).

Число живых клеток определяется по числу колоний, образуемых жизнеспособными клетками

диффузия
3. Активный транспорт
4. Фосфотранспортная система
Пути выведения метаболитов из

клетки

1. Пассивная диффузия
2. Облегченная диффузия
3. Активный транспорт
4. Фосфотранспортная система
5. Контрансляционная секреция
6. Фосфотрансферазная реакция

Окислительное фосфорилирование (дыхание)‏
С6Н12О6:
2С2Н5ОН + 2СО2 + 0,1 * 106 Дж

– спиртовое брожение
2СН3СНОНСООН + 0,075 * 106 Дж – молочно-кислое брожение
С3Н7СООН + 2СО2 + 2Н2 + 0,063 * 106 Дж – масляно-кислое брожение
2СН3СН2СООН + СН3СООН + СО2 + Н2О – пропионово-кислое брожение

2НАД ∙ Н2
МОЛОЧНО – КИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ:
С6Н12О6 = 2СН3СНОНСООН
СН3СОСООН + НАД

∙ Н2 = СН3СНОНСООН + НАД
ПРОПИОНОВО – КИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ:
3С6Н12О6 = 4СН3СН2СООН + 2СН3СООН + 2СО2 + 2Н2О
3СН3СНОНСООН = 2СН3СН2СООН + СН3СООН + СО2 + Н2О
МАСЛЯНО – КИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ:
С6Н12О6 = СН3СН2СН2СООН + 2СО2 + 2Н2
АЭРОБНЫЕ ПРОЦЕССЫ
ОКИСЛЕНИЕ ЭТИЛОВОГО СПИРТА ДО УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ:
СН3СН2ОН + О2 = СН3СООН + Н2О
ОКИСЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ ДО ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ:
2 С6Н12О6 + 3О2 = 2С6Н8О7 + 4Н2О

Q=2,87 * 106 Дж
Анаэробное дыхание:
NО3- + 2Н = NН3 –

нитратное дыхание
SО42- + 2Н = Н2S – сульфатное дыхание

и основные красители. К кислым красителям относятся эозин, кислый фуксин,

эритрозин и др. Эти красители интенсивно связываются с цитоплазматическими компонентами клетки.
Основные красители - метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, сафранин - интенсивнее связываются с ядерными компонентами клетки.
В микробиологической практике применяются почти исключительно основные красители.
Различают простые и сложные (дифференциальные) способы окраски микроорганизмов.

Для простой окраски используют только один краситель, чаще всего красного

цвета - фуксин, фиолетового - генцианвиолет (окраска производится в течение 1-2 мин) или синего - метиленовый синий (окраска производится в течение 3-5 мин).
Чтобы приготовить мазок, на середину чистого предметного стекла наносят небольшую каплю воды, с помощью бактериальной петли помещают в нее исследуемый материал и равномерно распределяют его на стекле до образования тонкого мазка.
Препарат высушивают и фиксируют над пламенем горелки. После окраски промывают водой и высушивают, после чего его можно микроскопировать.

фиолетового в течение 1-2 минут.

2. В течение 1 минуты обрабатывают

мазок раствором Люголя.

3. Обесцвечивают спиртом 10-20 сек.

4. Промывают водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина 1-2 минуты.

Метод окраски по Граму является важным диагностическим методом. Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамположительные - темно-фиолетового цвета и грамотрицательные - красного. Способность окрашиваться в тот или иной цвет зависит от строения их клеточной стенки и коррелирует со многими другими свойствами бактерий. у грамположительных бактерий имеется магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, отсутствующая у грамотрицательных. Она и образует прочный химический комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта.

(возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых.

1. Мазок окрашивают карболовым фуксином

Циля (основной краситель) при нагревании 3-5 мин.

2. Обесцвечивают раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение 1-2 мин.

3. Промывают водой.

4. Докрашивают 3-5 мин метиленовым синим (дополнительный краситель).

Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий отличается высоким содержанием липидов. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой.
Некислотоустойчивые бактерии легко окрашиваются, а затем легко обесцвечиваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем.

Кислотоустойчивые микроорганизмы окрашиваются в рубиново-красный цвет, некислотоустойчивые - в сине-голубой.

отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку

споры, которая плохо воспринимает красители. После протравы соляной кислотой при нагревании в течение 2-3 мин мазок фиксируется и окрашивается по методу Циля-Нильсена. При этом цитоплазма клетки окрашивается в синий цвет, а споры в красный.

Мазок окрашивается уксуснокислым метиленовым синим 2-3 минуты, при этом происходит

химическое взаимодействие красителя и волютина. Зерна волютина окрашиваются в черный цвет. При промывке водой тело клетки обесцвечивается и затем в течение 1 мин докрашивается везувином в желто-коричневый цвет.

фон, и не окрашиваются сами микроорганизмы. Для этого используют красители,

не окрашивающие бактерии, например тушь. Готовят тушевой препарат: каплю материала смешивают с каплей туши, готовят мазок (как мазок крови) и высушивают. В результате на темном фоне видны неокрашенные микроорганизмы.

и основан на том, что капсула не воспринимает красители. Капсулу

выявляют негативным контрастированием фона по Бури. Для этого черную тушь смешивают в культурой и высушивают. После этого проводят фиксацию в пламени горелки, окрашивают тела микробных клеток по Гинсу - водным фуксином в течение 1 минуты и промывают водой 5-10 секунд. В результате на темном фоне хорошо видна бесцветная капсула и красные тела микробов.

серебром вирусов, а также выявления микроструктуры бактерий (в том числе

риккетсий, спирохет), жгутиков, аргирофильных и аргентофильных включений и гранул. Принцип метода состоит в том, что при обработке аммиачным раствором серебра эта соль восстанавливается в исследуемом объекте и специфические ингредиенты объекта избирательно окрашиваются в коричневато-чёрный цвет. При этом капсиды вирионов не окрашиваются и наблюдаются ввиде светлого ободка, фон препарата - бесцветный или желтоватый.

Романовскому-Гимзе (смесью азура, эозина и метиленового синего). При окрашивании простейших

их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра - красно-фиолетовый. Этот метод используют также при исследовании риккетсий, хламидий, спирохет, форменных элементов крови.