Транспозиция и сайт-специфическая рекомбинация Рекомбинация – процесс

соединения в новых комбинациях.
Рекомбинация

Гомологическая

При такой рекомбинации разрезаемые и соединяемые концы ДНК должны содержать более или менее протяженные одинаковые последовательности.

Негомологическая

Одним из ее вариантов является сайт-специфическая рекомбинация, при которой перестройка ДНК происходит по коротким участкам строго определенной последовательности. Так происходит вырезание и интеграция фагов в бактериальную хромосому.

Транспозиция происходит при помощи негомологической рекомбинации и заключается в процессе участков ДНК из одного места генома в другое. Такие участки называются транспозонами.

(IR).

Разрезание донорной и акцепторной ДНК осуществляют ферменты под названием транспозазы.

происходит за счет формирования димера транспозазы, каждый мономер в составе

которого связан с IR.

Транспозаза в составе синапса осуществляет двуцепочечное разрезание донорной ДНК. При этом образуются липкие концы, обычно длиной от 2 до 9 нуклеотидов.

ДНК с такой же последовательностью, как и липкие концы IR.

В результате получается молекула как бы со встроенным транспозоном, но в то же время с «разрывами» длиной в исходный липкий конец IR.


Эти разрывы достраиваются бактериальной ДНК-полимеразой I, в результате чего, помимо встраивания транспозона, в акцепторной ДНК еще и формируются прямые повторы.

Их длина обычно в диапазоне 750-2000 нуклеотидов, и они почти

никогда не кодируют что-либо, кроме транспозазы.

Композитные, или составные транспозоны

Такие транспозоны состоят из двух одинаковых IS-элементов, перемещающихся по геному вместе с последовательностью, находящейся между ними. Последняя часто кодирует гены устойчивости к антибиотикам.

по отдельности, потому что:
Часто один из генов транспозазы инактивируется,
Еще

чаще IR мутируют так, что активными остаются только два самых концевых, то есть как раз IR композитного транспозона.

вследствие активности транспозонов, зачастую – именно композитных, так как они

часто содержат гены устойчивости к антибиотикам.

Это R-плазмида (R от resistance), содержащая кучу генов устойчивости. Поскольку все они фланкированы IS, очевидно, что тут постарались транспозоны.

и в то же время более сложные, чем IS-элемент.
Дальше поговорим

о некоторых вариантах транспозиции некомпозитных транспозонов.

разрывы в местах, обозначенных кружками.





Сформировавшиеся свободные гидроксилы атакуют нуклеотиды целевой

ДНК. Как именно происходит выбор нуклеотидов для атаки – не совсем ясно, может быть, что и случайным образом.

двух молекул ДНК, в каждой из которых есть одноцепочечный участок.

Натурально, эти участки достраиваются аппаратом репликации.





В результате формируется структура под названием коинтеграт – две сцепившиеся друг с другом молекулы ДНК, каждая из которых содержит последовательность Tn3. А в этой последовательности есть специальный участок для сайт-специфической рекомбинации – res. Она и происходит с участием фермента резользвазы, закодированного в бактериальной ДНК.

И теперь мы имеем две отдельные молекулы ДНК, в каждой из которых – по Tn3! Именно поэтому такая транспозиция называется репликативной: в этом случае не происходит вырезания транспозона, происходит его копирование.

в донорной ДНК (по одной молекуле на каждый из двух

концов). После этого транспозаза димеризуется, формируя синапс.


Каждая молекула транспозазы делает разрыв в «чужом» конце ДНК (то есть там, куда изначально села другая молекула транспозазы). Это приводит к формированию агрессивных 3’-концевых гидроксилов, которые моментально атакуют первое, что им подворачивается под руку, то есть 5’-концы противоположной цепочки ДНК. В результате этого в вырезанном транспозоне формируются так называемые 3’-5’-шпильки.

с целевой ДНК и сразу после этого осуществляют обратное разрезание

3’-5’-шпилек. Вновь сформировавшиеся агрессивные 3’-гидроксилы атакуют нуклеотиды на расстоянии 9bp друг от друга (на разных цепочках ДНК).





Происходит встраивание транспозона в целевую ДНК.





9-нуклеотидные разрывы достраиваются ДНК-полимеразой, в результате чего образуются прямые повторы.

Cut-and-paste – двуцепочечные

разрывы

Здесь формируется коинтеграт А здесь никаких коинтегратов нет!

Это Tn7, в норме переносящийся по механизму сut-and-paste. Его транспозаза – гетеродимер, состоящий из белков TnsA и TnsB, каждый из которых делает в ДНК ники. Так вот, если инактивировать TnsA, то оставшийся TnsB будет чудесно вносить одноцепочечные разрывы в ДНК, после этого будут формироваться коинтеграты, и транспозиция станет репликативной!

это два аспартата и один глутамат в активном центре транспозазы

таких транспозонов.

почти всегда содержат комплементарные друг другу куски, они слишком коротки,

чтобы по ним могла пройти гомологическая рекомбинация.

Для сайт-специфической рекомбинации нужны специальные ферменты, которые так и называются: сайт-специфические рекомбиназы. Их существует довольно много разных типов. Например, к ним относится уже знакомая нам резольваза транспозона Tn3, а также все тирозиновые и сериновые рекомбиназы.

Интегразы

Тип сайт-специфических рекомбиназ, действующий так же, как и резольвазы, разрезающие коинтеграты. Однако интегразы катализируют рекомбинацию между определенными участками двух разных молекул ДНК.
Мы уже знаем такие интегразы, как Int фага лямбда и, к примеру, интегративного конъюгирующего элемента Tn916.

к антибиотикам. Такие гены часто вырезаются откуда-нибудь (допустим, из плазмид)

и некоторое время существуют в виде кольца (это называется «кассета»). При этом в таком кольце должен быть участок, узнаваемый интегронной интегразой (attC). В самом интегроне есть ген интегразы intI1 и участок интеграции attI под сильным промотором. Интеграза узнает участки attI и attС и проводит рекомбинацию. В дальнейшем (в следующих поколениях) ситуация может повториться с другими генами устойчивости. В результате образуется чрезвычайно выгодный для хозяйской клетки генетический элемент!

Хороший пример – холерный вибрион, в геноме которого имеется так

называемый суперинтегрон, содержащий 179 кассет, кодирующие белки, функция большинства из которых неизвестна (но некоторые из них – точно белки устойчивости). Кассеты разделены участками, крайне напоминающие attI. Также в нужном месте имеется и ген интегразы. Хотя экспериментально и не показано, что это интегрон, больше такому участку быть вроде нечем.

мы специально говорить не будем, поскольку уже сделали это, разбирая

репликативную транспозицию Tn3).
Если резольвазы имеют дело с участками рекомбинации в прямой ориентации, то ДНК-инвертазы работают с инвертированными повторами, что приводит к инверсии последовательности ДНК, заключенной между ними.

Это участок инверсии сальмонеллы, ограниченный hix-повторами, и содержащий ген инвертазы hin и промотор, под которым расположены:
fljB – ген флагеллина Н2, сильного поверхностного антигена сальмонеллы,
fljA – ген репрессора fljC, кодирующего флагеллин Н1, другой сильный антиген.
Когда Hin осуществляет инверсию, вышеупомянутый промотор начинает смотреть в другую сторону, и с него ничего не синтезируется. Это значит, что флагеллина Н2 больше нет, а флагеллину Н1 ничто больше не мешает синтезироваться, что он и делает. Такая замена флагеллинов позволяет сальмонелле быть более устойчивой к хозяйской иммунной системе.

на две группы: тирозиновые (Y) и сериновые (S). Соответственно, либо

тирозин, либо серин является основной аминокислотой каталитического центра фермента, играющей критическую роль при осуществлении акта рекомбинации.

Тирозиновые рекомбиназы Сериновые рекомбиназы

рекомбинирующие молекулы, в каждой из которых есть по 2 RBE-участка

(recombinase binding element, инвертированные повторы). Тирозины активных центров двух молекул фермента атакуют определенные нуклеотиды сайта рекомбинации и вносят в них одноцепочечные разрывы, ковалентно связываясь с их 3’-концами и формируя 5’-гидроксильные группы.
Каждый 5’-гидроксил атакует противоположную 3’-фосфорилтирозиновую связь, вызывая тем самым «переброс» цепочек ДНК. При этом формируются 3-4 новых водородных связи между цепочками ДНК, ранее принадлежавшим к разным молекулам.

5’-гидроксилами 3’-фосфорилтирозиновых связей создаются две новые фосфодиэфирные связи и формируется

структура Холидея, которая изомеризуется (не до конца ясно как) .

подает сигнал двум пока незадействованным молекулам рекомбиназы, которые активизируются и

делают все то же самое, только с двумя не участвовавшими в процессе ранее цепочками ДНК.
В результате получаются две новых двуцепочечных молекулы ДНК, каждая из которых состоит из половины одной и половины другой исходных молекул.

связывают две молекулы ДНК по сайтам RBE. Серины активных центров

атакуют фосфодиэфирные связи в определенных положениях (причем работают сразу все 4 фермента, а не два, как в случае Y).


В результате обе молекулы ДНК разрезаются по обеим цепочкам с образованием свободных 3’-гидроксилов и 5’-фосфорилсериновых связей.



Далее каким-то образом происходит переворот одной из двух половин комплекса на 180 градусов. Строгого доказательства этому нет, но (1) есть косвенные указания, (2) как-то по-другому представить себе процесс не получается.

происходит сближение фрагментов ДНК, принадлежавших разным исходным молекулам.
После этого 3’-гидроксилы

атакуют 5’-фосфорилсериновые связи, наводятся новые фосфодиэфирные связи и получаются два продукта рекомбинации!