УФ и видимый диапазоны спектра

нм
315 нм
С
B
A
С – поддиапазон: полностью задерживается озоновым слоем в стратосфере

на высоте около 50 км (особо цитотоксичен).
В – поддиапазон: поверхности земли достигает около 10% исходного (цито-
токсичен).
А – поддиапазон: достигает поверхности земли. Только этот поддиапазон
УФ вызывает фотоэффекты у живых объектов, необ-
ходимые для процессов их жизнедеятельности.

800 нм

поглощается и излучается отдельными порциями. Эти порции энергии обладают свойствами

материальной частицы и называются квантами излучения или фотонами.

Энергия кванта (фотона):
h
Е = h x ν; ν =
λ
h – постоянная Планка
- частота, Гц

Энергия кванта прямо пропорциональна частоте (ν)
и обратно пропорциональна длине волны (λ).

областях спектра служит для:

Высокочувствительного

качественного анализа
сложных смесей веществ.
- Высокочувствительного количественного анализа.
Изучения структуры веществ, а также для оценки
её изменений в различных условиях.

Достоинства:
Изучаемые вещества не разрушаются.
Высокая чувствительность методов.
Высокая специфичность методов.
Возможность обнаружения низких концентраций
веществ в составе сложных смесей без их пред-
варительного разделения.

веществом.
При этом энергия кванта не поглощается веществом,

квант
изменяет свое направление – происходит рассеивание свето-
вого излучения.

2. Квант светового излучения поглощается веществом. Это обу-
словлено тем, что сама молекула (функциональная группа в
составе молекулы) является хромофором. Именно хромофор
поглощает энергию кванта.

Хромофор поглощает только те кванты, энергия которых равна
разнице энергий электронов хромофора в его основном и воз-бужденном состояниях:
hν = Ee-возб. сост. - Ee-осн. сост.

Этим объясняется феномен: разные вещества (хромофоры)
поглощают световые излучения с разной длиной волны (λ).

(So) – вещество не поглощает и не излучает энер-
гию.

Когда вещество поглощает квант энергии – происхо-
дит его переход в возбужденное (S1) состояние.
S – синглетное состояние (спин е- не меняется)

hν

тепло

So

S1

Электроны переходят с орбита-
лей нижних энергетических уров-
ней на орбитали с высоким энер-
гетическим уровнем (спин е- со-
храняется).
S1 – состояние длится 10-8 -10-9 с

В растворе возбужденная молекула соударяется
c другими молекулами с частотой 10-12 с, теряет
энергию и возвращается в состояние So.

Схема электронной
орбитали и её
энергетических
подуровней

(светопропускание) = I x 100% / Io
Е, А (ABS),

D (экстинкция, оптическая плотность) = lg Io/ I

Закон выражает связь между E и С:
E = ε x C x l
C – mol/l; l – толщина слоя, см; ε − молярный коэффициент
экстинкции, l / (mol x см)

Как измерить интенсивность прошедшего светового потока?

Исходный световой поток

Прошедший световой поток

плотность (D, E)
Концентрация, С
При неизменной толщине слоя – прямая,
выходящая

из начала координат

tg угла наклона - ε

Cк

Отрицательное
отклонение
от закона
Ламберта – Бугера-Бэра

реакции ассоциации, диссоциации или химичес-
кие взаимодействия соединения с

растворите-
лем (хим. реакции продолжают происходить в
кювете спектрофотометра);

флуоресценция анализируемого вещества в
растворе. Весь вторичный световой поток попа-
дает на фотоэлемент. При большой толщине
слоя – происходит тушение флуоресценции;

спектральной
щели. При этом могут быть существенные отличия
в

распределении интенсивности световых пучков с
разной λ. Это особенно сильно проявляется у
веществ с очень узким диапазоном поглощения.
Для устранения возможной ошибки выбирают ши-
рину спектральной щели < полуширины исследу-
емой полосы (1/2 Δλ);

присутствие рассеянного и/или отраженного света
(дефекты призм, зеркал, пыль и тд.);

неисправность фотоэлемента, усилителя прибора.

количества поглощенного света от длины волны.
У каждого вещества

спектр поглощения уникален – это его «молекулярный паспорт».

Спектры поглощения Hb (I), окси-Hb (II) и
карбокси-Hb (III)

Поглощение гема идет в обл. 400 нм – поло-
са Соре.
Окси-Hb при: ~414 и 543 нм;
Карбокси-Hb при: 420 и 560 нм.

Точные положения пиков
поглощения уникальны для
различных видов животных.

(НАД и НАДФ).
Поглощение при λ 260 нм обусловлено
адениновым кольцом. Для

восстанов-
ленной формы характерно снижение
поглощения при 260 нм и появление
интенсивного поглощения при 340 нм.
Окисленная форма поглощает
только при 260 нм.

света
Спектральный диапазон: λ 315 – 700

нм
λ задается светофильтрами (иногда дифракционной
решеткой)
Светофильтр выделяет полихромный световой поток
Для измерений используют кюветы из оптического
стекла
2. Спектрофотометр:
Для УФ и видимой областей – отдельные источники света
Спектральный диапазон: λ 200 – 1000 нм
λ задается монохроматором
Монохроматор выделяет монохромный световой поток
Для измерений в УФ-диапазоне используются кюветы из
кварцевого стекла.

507 нм, красным – фильтр на 555 нм
Относительное пропускание

светофильтров

анализ);
2. Регистрация течения химических превращений;
3. Идентификация веществ в растворе (спектр поглоще-
ния – «молекулярный паспорт» вещества – качествен-
ный анализ);
4. Регистрация изменений физико-химических свойств
молекул (денатурация-ренатурация ДНК) и т.д.

в
растворе (преципитат в результате взаимодействия антигена и

антитела).
1
Теория светорассеивания разработана Рэлеем: Iр =
λ4

А. Dчастицы < 1/10 λ Б. Dчастицы > 1/10 λ В. Dчастицы > λ

Io

I

Io

Ip

I

I

Io

Ip

Ip

Ip

Рассеивание
идет
симметрично

Рассеивание
идет не сим-
метрично

Рассеянный свет
почти совпадает
с прошедшим

Ip

на измерении интенсивности про-шедшего через образец (не рассеянного) света.

Реализуется с помощью обычного фотометра.
Выбирают светофильтр, обеспечивающий световой поток с минимальной λ. Метод эффективен, если
образец рассеивает не менее 10% от величины Io.

2. Нефелометрия.
Метод основан на измерении интенсивности рассеянного образцом света. Метод более чувстви-
телен, чем турбидиметрия, реализуется с помощью
специального прибора – нефелометра. Через обра-зец пропускают свет с λ = 600-700 нм (при большой λ
шире диапазон D частиц, рассеивающих свет).