Хроматография

анализа смесей веществ, а также изучения физико-химических свойств веществ.
Михаил Семенович

Цвет
(1872 – 1919)

М.С. Цвет изобрел метод в 1900 г., решая задачу по разделению раститель-ных пигментов в экстракте.
Первая международная публикация
метода состоялась в 1903 году, в кото-рой автор впервые применил термин
«хроматография».

фазами: одна неподвижна (имеет раз-
витую поверхность), другая фаза – поток,

который фильтруется через неподвижную
фазу».
М.С.Цвет
По современной терминологии неподвижную фазу называют матрицей или сорбентом, а подвижную фазу – элюентом.

многих смущала простота метода, со-
четающаяся с его большими аналитическими возможностями.

В

1918 году М.С. Цвет номинировался на Нобелевскую премию,
но награда не была ему присуждена.

До середины 20-х годов о методе почти забыли.

На рубеже 20 и 30-х годов хроматографию «открыли» во
второй раз.
В 1944 году Дж. Мартин и Р. Синдж получили Нобелевскую
премию по химии за разработку метода распределительной
хроматографии.

По современной классификации хроматографических методов,
вид хроматографии, открытый М.С. Цветом, следует отнести
к адсорбционной хроматографии.

молекулярной биологии
ХХ века всецело обязаны методам хроматографии.

В настоящее время

хроматографические методы широко
используются для качественного и количественного анализа
в органической и неорганической химии, фармакологии и
других науках.

в системе
двух фаз: стационарной и подвижной. Под-
вижная фаза увлекает

компоненты смеси,
которые многократно перераспределяются
между двумя фазами. Сродство компонентов
смеси к фазам не одинаково. Это и опреде-
ляет разницу скоростей движения разных
компонентов смеси вдоль неподвижной фазы.
Благодаря этому компоненты смеси физичес-
ки отделяются друг от друга – происходит
разделение компонентов смеси.

матри-
ца, сорбент) может быть:
твердой
жидкой
смесь твердой и жидкой

фаз.

подвижная фаза (элюент) может быть:
- жидкой
- газообразной

фазами – коэффициент
распределения (Kd):

[вещества]

в неподвижной ф.
Kd =
[вещества] в подвижной ф.

и неподвижную фазы
так, чтобы Kd для компонентов
был максимально

различным.

Kd > 1 – основная часть вещества связана с
неподвижной фазой
Kd ≈ 0 - основная часть вещества связана с
подвижной фазой
Kd = 1 – вещество в одинаковой мере свя-
зано с обеими фазами

0

Kd < 1

Газо-твёрдофазная хроматография
Жидкостная хроматография
Жидкостно-жидкостная хроматография
Жидкостно-твёрдофазная хроматография
Жидкостно-гелевая хроматография

Сверхкритическая флюидная хроматография

трубке, запол-
ненной хроматографическим сорбентом.
Капиллярная хроматография
Разновидность колоночной хроматографии; для

разделения
используют трубку (капилляриспользуют трубку (капилляр), в которой слой сорбента
расположен только на внутренних стенках колонки,
а центральная часть остается свободной.
Плоскостная хроматография
Для разделения используют плоский слой сорбента
небольшой толщины.
Бумажная хроматография
В качестве неподвижной фазы используют специальную
бумагу для хроматографии
Тонкослойная хроматография
Неподвижная фаза представляет собой тонкий слой сорбента
(напр. силикагель), закрепленный на инертной подложке
(напр. из алюминия)

газо-жидкостная хроматография

Проникающая хроматография (гель-хро-матография, гель-фильтрация, молекулярно-ситовая хроматография)

Адсорбционная хроматография

Ионообменная хроматография

Аффинная хроматография

связанная

вода не смешивается с подвижной фазой).
Подвижная фаза – смешивающиеся или не смешивающи-
еся с водой орг. растворители).

Разделение проводится в специальных гермети-
чески закрытых стеклянных камерах, которые
предварительно насыщаются парами подвижной
фазы. Подвижную фазу наливают на дно камеры.
Подвижная фаза движется вдоль матрицы в виде
фронта под действием капиллярных сил от линии
«старт» до линии «финиш».

factor):

L, пройденное веществом от старта
Rf =
L, пройденное растворителем от старта
до финиша

В стандартных условиях для конкретного компо-
нента смеси, Rf = consta. Это позволяет использо-
вать его значение для идентификации компонента
смеси на хроматограмме.
Разделение: пептидов, аминокислот, моно- и ди-
сахаридов, растительных пигментов.

порошок целлюлозы, нанесенные на сте-
кло или плотную алюминиевую фольгу.
Подвижная фаза

– смесь 2-х и более орг. растворителей,
включая воду.
Техника разделения – сходна с хроматографией
на бумаге.
Аналитические цели – толщина слоя: доли мм.
Препаративный вариант – толщина слоя до 5 мм.
Преимущества перед ХГ на бумаге:
быстрота
шире возможности (большой выбор сорбентов)
высокая разрешающая способность
Разделение: пептиды, аминокислоты, НК, алкалоиды, сте-
роиды, сахара, ЖК, ФЛ, ТАГ, витамины, каротиноиды и др.

тонкой металлической трубки
(длина 30 – 100 м). Эта фаза должна

быть химически
нейтральна по отношению к разделяемой смеси.
Подвижная фаза – инертные газы-носители (аргон, азот).

Смесь перед подачей в колонку нагревают до парообразно-
го состояния и вдоль колонки идет смесь пары+газ носи-
тель. Нелетучие вещества предварительно превращают в
летучие путем метилирования, ацилирования, алкилирова-
ния и т.д. По всей длине колонки поддерживается темпера-
тура, при которой смесь остается в виде паров. В связи с
этим, анализу могут подвергаться только те вещества,
которые не разрушаются при нагревании и переходе в
парообразное состояние.

ществ в концентрации до 10-12 г.)
сравнительно высокая скорость анализа

метод высокоэффективен для решения как
аналитических, так и препаративных задач
(высокая степень очистки).

Разделение: стероиды, барбитураты, ЖК, эфиры, спирты, амины, ароматические соедине-ния, углеводы, стероиды и т.д.

ХГ.


В основе принципа разделения компонентов смеси – эф-
фект «молекулярного сита».

Стационарная фаза пред-
ставляет собой пористый материал: органические поли-
меры с 3D – сетчатой структурой. Обязательное условие –
стационарная и подвижная фазы должны быть химически
и биологически нейтральны по отношению к компонентам
разделямой смеси.
«Молекулярное сито» - компоненты смеси, в зависимости
от своих размеров, либо проникают внутрь 3D–сетчатой
структуры (гранулы) и удерживаются там некоторое вре-
мя, либо свободно двигаются по пространству между гранул, увлекаемые потоком подвижной фазы.

органических полимеров,
образующих 3D – сетчатую структуру (гранулу). Эта вода
образует гидратную

оболочку на поверхности волокон.
Подвижная фаза – вода или буфер, которые заполняют
пространство вне гранул, эта фаза постоянно движется с
заданной скоростью.

Т.о. вода (буфер) – и стационарная, и подвижная фазы.
Связанная вода (в составе гидратной оболочки волокон),
никогда не перемешивается с водой подвижной фазы.

Фактор, определяющий возможность разделения компо-
нентов смеси – соотношение размеров молекул компонен-
тов смеси и размера пор, через которые внутренний
объем гранул сообщается с внешним пространством.

(«Sephadex»)
гель на основе агарозы («Sepharose»)
гель полиакриламидный (ПААГ), «Биогель»

и др.

Достоинства гель-хроматографии:
- эффективность разделения смеси белков не зависит от
рН, То, ионной силы буфера, химического состава буфе-
ра и др. условий
отсутствие адсорбции компонентов смеси на волокнах
стационарной фазы и взаимодействия эл. зарядов.

Применение:
высокая степень разделения и очистки белков и нукле-
иновых кислот с сохранением их нативных свойств
- концентрирование растворов белков
точное определение молекулярной массы белков на ос-
нове зависимости элюционного объема и lg мол. массы.

кремневая кислота, окиси К и
Mg, карбонаты Сa и Zn,

силикагель и др.
Подвижная фаза – как правило, различные орг. раство-
рители.

При адсорбции, молекулы из разделяемой смеси
притягиваются к поверхности адсорбента за счет
их химического сродства. Это не случай электро-
статического притяжения к поверхности адсор-
бента молекул, имеющих с ним разноименные
заряды.

адсорбции компонен-
тов смеси на поверхности сорбента и их растворимостью
в

подвижной фазе. Если стационарная фаза пористая,
то в процессе разделения компонентов смеси участвуют
также процессы диффузии (черты гель-хроматографии).

Ко-во адсорбированного вещества

Концентрация вещества в растворе

Изотерма адсорбции –
сродство растворенного
вещества к данному адсор-
бенту.
Чем сильнее отличаются
изотермы компонентов сме-
си, тем лучше будет прохо-
дить их разделение.

В-1

В-2

В-4

В-3

могут иметь
разное соотношение высоты и внутреннего диа-
метра («геометрия хроматографической ко-
лонки»):
1.

Для очистки белков (макромолекул) от низко-
молекулярных примесей требуется H/D < 10:1
2. Для разделения смеси белков (хроматографи-
ческое фракционирование) требуется
H/D = 100 : 1

Разделение: стерины, белки, аминокислоты,
пептиды, углеводы, нуклеиновые кислоты и др.

данного вида хроматографии – наличие у них
электрического заряда. Удержание отдельных

компонентов
смеси на стационарной фазе идет благодаря электроста-
тическому притяжению разноименных зарядов.

Стационарная фаза – твердый носитель (3D-сетчатая
матрица: декстран, целлюлоза и др.), содержащий на по-
верхности заряженные группы – ионогенные группы.
Если матрица несет –q, то это катионообменник ( R-SO3-);
если имеет +q, то это анионообменник: R-N+(CH3)3.

Подвижная фаза – водная: буферы с изменяемым рН или с добавлениями солей для регулируемого изменения ионной силы.

и анионоообменниками.
на основе целлюлозы: катионообменник – кар-
боксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза);

анионо-
обменник – диэтиламиноэтил целлюлоза
(ДЭАЭ-целлюлоза).

при котором ионо-
генные гр. полностью ионизированы и свя-заны с противоионом

– катионом буфера.

Смесь внесена в колонку. Катион Б+
из подвижной фазы вытесняет про-
тивоион и занимает его место.

Н+или Na+

Для удаления из ионогенной гр. ка-
тиона Б+ можно: а). промыть колонку
буфером с более кислым значением
рН, либо б). не меняя исходное зна-
чение рН, повысить ионную силу –
увеличить [Na+]. В обоих случаях
катион Б+ выходит в подвижную фазу.

1

2

3

4

др. молекулы, способные в
водном растворе нести электрические заряды.

антиген – антитело, рецептор – гормон, фермент – суб-страт.

Стационарная фаза

(матрица) – агароза, с которой ковалентно связан соответствующий лиганд. Выбор лиганда определяется биологическими свойствами биомолекул, подлежащих очистке.
Подвижная фаза – буфер, рН и ионная сила которого
обеспечивает оптимальные условия для связывания биомолекулы с лигандом.

этапы:
Заполнение колонки буфером, содержащим смесь ком-
понентов, в том

числе БАВ, который необходимо очис-
тить от примесей. В результате образуется комплекс:
лиганд-БАВ.
2. Колонку промывают другим буфером, что позволяет
удалить из колонки неспецифически адсорбирован-
ные примеси.
3. Колонку промывают третьим буфером, который содер-
жит хим. компоненты, облегчающие диссоциацию ком-
плекса лиганд-БАВ и выходу очищенного БАВ в под-
вижную фазу и далее – из колонки.

с матрицей (грану-
лированный гель).
Нужный БАВ, содержащийся в
исходной смеси, связывается

со
своим лигандом на основе био-
логического сродства (аффинитета).
Другие компоненты смеси легко
отмываются.

Десорбция БАВ с геля достигается
контролируемым изменением рН
и/или изменением концентрации
элюента.

целом ряде случаев, методу аффинной хроматографии
нет альтернативы. Степень очистки БАВ

с помощью дан-
ного типа хроматографии существенно выше, чем при
гель-хроматографии.

* * *