Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

копий специфических
нуклеотидных последовательностей

пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C.

Современные амплификаторы позволяют

задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C..

Амплификатор

нажми на картинку

требуется амплифицировать.

Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей

требуемого фрагмента ДНК.

Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись.

Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК.

Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом.

Температура отжига зависит

от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин.

Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Это — стадия элонгации.

Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца

праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы.

Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C.