Слайд 2Причины появления повреждений в ДНК
• Ошибки репликации
• Повреждения ДНК эндогенными
агентами
гидролиз
(депуринизация, дезаминирование)
• Повреждения ДНК экзогенными агентами
облучение
повреждение химическими агентами (например, алкилирование)
•
Репликация «через повреждения» с использованием полимераз, отличающихся низкой точностью копирования
Повреждение ДНК – любое изменение ДНК, которое вызывает отклонение от двуцепочечной структуры
Слайд 3Типы повреждений ДНК
На уровне одного нуклеотида
• Отсутствие основания
• Некомплементарное
основание
• Основание с нарушенной структурой
Структурные
• Одноцепочечные разрывы
• Неспецифические связи между
цепями
• Двухцепочечные разрывы
Слайд 5Репарация ДНК
гидролиз
метилирование
окисление
Основные места повреждений
Слайд 7Дезаминирование
основание
мутаген
(азотистая кислота)
модиф.
основание
партнер по
спариванию
мутагенный
эффект
Слайд 8Алкилирование
этилметансульфонат
(EMS)
Слайд 9Образование тиминовых димеров под действием УФ-света
Циклобутановый
пиримидиновый
димер
Изгиб ДНК 7-9°
Пиримидин-6-4-пиримидинон
Изгиб ДНК
44°
Слайд 10Тиминовые димеры изменяют структуру ДНК
Слайд 11Репарация ДНК
несколько повреждений,
расположенных рядом,
межнуклеотидные сшивки,
в том числе, циклобутановые димеры
повреждения
единичных
нуклеотидов (гидролиз,
дезаминмрование,
алкилирование и т.д.)
повреждения ДНК
объемные (bulky)
точечные (non-bulky)
Слайд 12Репарация ДНК
Стратегии коррекции повреждений
Ошибки репликации:
исправление ошибок ДНК полимеразой
(3’-5’ экзонуклеаза),
репарация неспареных оснований (mismatch repair)
Повреждение
ДНК эндогенными и экзогенными агентами:
Прямое удаление повреждений
Вырезание (эксцизия) оснований (base excision repair)
Вырезание (эксцизия) нуклеотидов (nucleotide excision repair)
Рекомбинация
[Черезблоковый синтез особыми полимеразами (не удаляет ошибок но позволяет продолжить репликацию)]
Слайд 13Репарация ДНК
Прямое исправление повреждений (Direct reversal) (2 и >)
2. Эксцизионная
репарация оснований (Base excision repair (BER)) (15)
3. Эксцизионная репарация нуклеотидов
(Nucleotides excision repair (NER)) (28)
4. Репарация неправильно спаренных нуклеотидов (Mismatch repair (MMR)) (11)
5. Синтез через повреждения (СОС-ответ) (Trans-lesion synthesis (SOS-response))
6. Репарация при помощи рекомбинации (Repair via recombination) (14)
7. Репарация двойных разрывов (Double strand break repair) (5)
Пути репарации ДНК
Слайд 14Образование тиминовых димеров под действием УФ-света
Циклобутановый
пиримидиновый
димер
Изгиб ДНК 7-9°
Пиримидин-6-4-пиримидинон
Изгиб ДНК
44°
Слайд 15Репарация ДНК
прямое исправление повреждений – фотореактивация
ДНК-фотолиазы, мономерные флавин-зависимый ферменты
Кофакторы :
FADH- и 5,10-метенилтетрагидрофолат (5,10-MTHF)
Фотолиаза связывается в темноте с димерами ТТ
На
свету кофактор (5,10-MTHF) абсорбирует фотон и передает энергию возбуждения на FADH-
Возбужденный FADH- отдает электрон пиримидиновому димеру, устраняя повреждение
Фотолиаза освобождает ДНК
В клетках млекопитающих не найдены!
Слайд 16Репарация ДНК
прямое исправление повреждений – фотореактивация
Слайд 17Репарация ДНК
Алкилирование нуклеотидов
Слайд 18SN2 mechanism
TA CG
GC AT
Репарация ДНК
прямое исправление повреждений –
О6-метилгуанин метил
трансфераза
Ada (E.coli)
Слайд 19Репарация ДНК
прямое исправление алкилированных нуклеотидов
Слайд 20Репарация ДНК
Алкилирование нуклеотидов
Слайд 21Репарация ДНК
прямое исправление алкилированных нуклеотидов
•Оксидоредуктазы: Alk B (E.coli), hABH2 и
hABH3 (Human)
относятся к кетоглутарат/Fe(II)-зависимому суперсемейству диоксигеназ,
в процессе репарации протекает
совместно декарбоксилирование
кетоглутарата и окислительное деметилирование поврежденного
основания
•Субстрат: 1meA, 3meC
Слайд 22Репарация ДНК
прямое исправление алкилированных нуклеотидов
Слайд 23Репарация ДНК
Алкилирование нуклеотидов
Слайд 24ДНК-гликозилаза AlkA
Репарация
алкилированых нуклеотидов
Слайд 25Репарация ДНК
Прямое исправление повреждений (Direct reversal) (2 и >)
2. Эксцизионная
репарация оснований (Base excision repair (BER)) (15)
3. Эксцизионная репарация нуклеотидов
(Nucleotides excision repair (NER)) (28)
4. Репарация неправильно спаренных нуклеотидов (Mismatch repair (MMR)) (11)
5. Синтез через повреждения (СОС-ответ) (Trans-lesion synthesis (SOS-response))
6. Репарация при помощи рекомбинации (Repair via recombination) (14)
7. Репарация двойных разрывов (Double strand break repair) (5)
Пути репарации ДНК
Слайд 26Репарация ДНК (BER)
Различные ДНК-гликозилазы адресно узнают поврежденные основания и удаляют
их, разрезая гликозидную связь. При этом возникает AP (апуриновый/апиримидиновый) сайт.
В клетке существует несколько АР эндонуклеаз, которые разрезают фосфодиэфирный остов ДНК рядом с AP сайтом
AP нуклеотид удаляется экзонуклеазой/дезоксирибофосфодиэстеразой и «брешь» застраивается ДНК полимеразой
Слайд 27ДНК гликозилазы «выворачивают» модифицированное основание
наружу и отщепляют его от
сахарофосфатного остова
Репарация ДНК
Слайд 29Основные типы повреждений, которые удаляются посредством BER
(большая часть не блокирует
репликацию)
Окисленные основания, в том числе 8-oкси-G, который спаривается с А,
вызывая GC --> TA трансверсии
Дезоксиурацил
Различные продукты алкилирования оснований (например, 3-meA)
Спонтанно возникающие апуриновые сайты
Слайд 31Репарация ДНК (BER)
Монофункциональные ДНК-гликозилазы расщепляют N-гликозидную
связь с модифицированным основанием
и приводят к образованию АР-сайта.
Бифункциональные ДНК-гликозилазы кроме расщепления N-гликозидной
связи
с модифицированным основанием способны удалять 3'-фосфатную
группу путем бета-элиминирования, образуя в ДНК одноцепочечный разрыв.
Некоторые бифункциональные ДНК-гликозилазы способны
осуществлять вторую реакцию бета-элиминирования, приводящую к
разрыву связи с 5'-фосфатной группой.
Слайд 32Репарация ДНК (BER)
Все три варианта продуктов ДНК-гликозилаз являются субстратами апуриновой/апиримидиновой
эндонуклеазы, которая путем гидролиза фосфодиэфирной связи, расположенной с 5′-стороны от
АР-сайта, вносит разрыв в рибозофосфатный остов, либо удаляет оставшийся дезоксирибофосфатный остаток, или фосфатную группу. В результате действия АР-эндонуклеазы на 3'-конце разрыва образуется гидроксильная группа.
Слайд 33Репарация ДНК (BER)
На следующих этапах по этому 3'-концу происходит присоединение
комплементарного нуклеотида репарационными ДНК-полимеразами, и, затем, ДНК-лигаза заканчивает процесс, восстанавливая
целостность дезоксирибофосфатного остова.
Слайд 34Репарация ДНК (NIR)
Некоторые AP эндонуклеазы (например, APE1) могут работать как
сенсор повреждений. Помимо AP сайтов они узнают ряд других повреждений,
в том числе окисленные основания.
Эта активность важна для альтернативного пути репарации единичных повреждений (nucleotide incision repair, NIR).
Преимущество:
нет апуринового сайта, который сам по себе может быть опасным для клетки
Слайд 35Репарация ДНК (BER)
роль белка PARP1 (Поли(АДФ-рибоза)-полимераза 1)
Слайд 36Поли(АДФ-рибоза)-полимеразы катализируют поли-АДФ-рибозилирование
Слайд 38Репарация ДНК
Прямое исправление повреждений (Direct reversal) (2 и >)
2. Эксцизионная
репарация оснований (Base excision repair (BER)) (15)
3. Эксцизионная репарация нуклеотидов
(Nucleotides excision repair (NER)) (28)
4. Репарация неправильно спаренных нуклеотидов (Mismatch repair (MMR)) (11)
5. Синтез через повреждения (СОС-ответ) (Trans-lesion synthesis (SOS-response))
6. Репарация при помощи рекомбинации (Repair via recombination) (14)
7. Репарация двойных разрывов (Double strand break repair) (5)
Пути репарации ДНК
Слайд 39Репарация ДНК (NER)
Используется для коррекции «серьезных» повреждений, которые блокируют репликацию
(например, у человека – тиминовые димеры).
1. Специальные белки узнают
поврежденные участки ДНК и привлекают
специальные нуклеазы, которые вносят разрывы на некотором расстоянии перед повреждением и на некотором расстоянии после него.
2. Фрагмент ДНК, содержащий повреждение, удаляется, и образовавшаяся брешь застраивается ДНК полимеразой
Слайд 41Репарация ДНК
NER в клетках E. Coli : UvrA, UvrB, UvrC,
UvrD
1. UvrA и UvrB сканируют ДНК и выявляют поврежденные места
2. После выявления поврежденного участка UvrA освобождается из комплекса, а UvrB вызывает локальную денатурацию поврежденного участка и привлекает UvrC
Слайд 42Репарация ДНК
NER в клетках E. Coli : UvrA, UvrB, UvrC,
UvrD
3. Комплекс UvrBС вносит однонитевые разрывы с 5’- и 3’-
конца от повреждения.
4. DNA-хеликаза UvrD обеспечивает удаление из дуплекса фрагмента ДНК, содержащего повреждение.
5. DNA Pol I застраивает брешь и лигаза «зашивает» однонитевой разрыв.
Слайд 43Репарация ДНК
NER в клетках E. Coli : UvrA, UvrB, UvrC,
UvrD
Практически вся эксцизионная репарация в клетках
E.coli проходит за счет
UvrABC
В 99% случаев длина «заплатки» 12 н.о. –
ремонт короткими «заплатками»
1% – примерно 1500 н.о. (бывает > 9000 н.о.) –
ремонт длинными «заплатками»
Слайд 44Репарация ДНК
NER в клетках E. Coli : UvrA, UvrB, UvrC,
UvrD
Mutation Frequency Decline (Mfd) =Transcription Repair Coupling Factor (TRCF)
При повреждении
ДНК в первую очередь репарируются транскрибируемые участки:
Белок Mfd (TRCF)
1. распознает остановившуюся РНК-полимеразу,
2. вытесняет ее из комплекса
3. привлекает на место повреждения UvrAB
Слайд 45Репарация ДНК
NER в эукариотических клетках
Основной принцип NER в клетках эукариот
такой же, как и в бактериальных: репарируются крупные повреждения, полученные
под действием УФ-света, сшивающих агентов, химических канцерогенов, путем вырезания фрагмента ДНК
Два пути NER:
1. Система глобальной геномной репарации (GG-NER)
2. Репарация ДНК, связанная с транскрипцией (TC-NER)
Нарушения работе NER ведут к серьезным заболеваниям.
Пигментная ксеродерма (Xeroderma Pigmentosum) (XP)
рецессивное заболевание, семь генов (XPA-XPG)
1-4 случая на 1 000 000 человек
чувствительность к солнечному свету, особенно к УФ,
дефекты в работе ранних этапов NER
Слайд 46Репарация ДНК
GG-NER в эукариотических клетках
a, b) Белок XPC в комплексе
c HR23B
и цетрином 2 распознает повреждение
c) и привлекает
фактор транскрипции
TFIIH, который за счет хеликазной активности расплетает двойную спираль ДНК. TFIIH – большой комплекс, в состав которого входят XPB (хеликаза и АТФ-аза, расплавляет промотор при транскрипции) и XPD (хеликаза, необходимая для репарации)
d, e) Эндонуклеазы XPG (=FEN1) и XPF вносят разрывы с двух сторон
f) поврежденный участок (25-30 нуклеотидов) замещается за счет синтеза. Одноцепочечный разрыв зашивает лигаза.
Слайд 47Репарация ДНК
TC-NER в эукариотических клетках
a) Транскрипционный комплекс остановился на повреждении.
TFIIH уже в его составе, поэтому репарация транскрибируемых участков идет
с большей эффективностью
b, c) Белки CSA и CSB распознают такую остановку и освобождают поврежденное место от полимеразы
d) Выбор пути репарации
e) Возвращение полимеразы и продолжение транскрипции
Слайд 48Репарация ДНК
Прямое исправление повреждений (Direct reversal) (2 и >)
2. Эксцизионная
репарация оснований (Base excision repair (BER)) (15)
3. Эксцизионная репарация нуклеотидов
(Nucleotides excision repair (NER)) (28)
4. Репарация неправильно спаренных нуклеотидов (Mismatch repair (MMR)) (11)
5. Синтез через повреждения (СОС-ответ) (Trans-lesion synthesis (SOS-response))
6. Репарация при помощи рекомбинации (Repair via recombination) (14)
7. Репарация двойных разрывов (Double strand break repair) (5)
Пути репарации ДНК
Слайд 49Репарация ДНК (MMR)
ДНК полимеразы (даже те, у которых есть корректирующая
активность) все равно делают ошибки, которые надо исправлять
Система репарации ошибок
репликации должна
1. Быстро находить ошибки
2. Различать родительскую и новосинтезированную
цепь с тем, чтобы в неспаренном участке
заменить ошибочно включенный нуклеотид
Слайд 50Репарация ДНК (MMR)
1. MutS2 сканирует ДНК. Ошибки индуцируют нарушения в
правильной структуре двойной спирали.
2. Найдя ошибку, MutS2 изменяет конформацию,
что закрепляет его на цепи ДНК.
3.В комплекс привлекается 2 молекулы MutL. MutS2L2 протягивает ДНК до обнаружения метилированного сайта GATC
4. Узнавание метилированного GATC заставляет эндонуклеазу MutH связаться с MutS2L2.
В клетках E. Coli
Слайд 51Репарация ДНК (MMR)
5. MutH разрезает неметилированную цепь.
6. Фрагмент ДНК от
сайта метилирования до ошибочного основания вырезается экзонуклеазами при поддержке хеликазы
UvrD
7. ДНК-ролимераза III застраивает брешь, лигаза зашивает одноцепочечный разрыв.
В клетках E. Coli
Слайд 52Репарация ДНК (MMR)
В клетках эукариот
гомологи MutS (MSH — MutS homolog)
образуют два гетеродимерных комплекса
-- MSH2-MSH6 (MutSα) узнает неспаренные нуклеотиды
и короткие «инделы»
-- MSH2-MSH3 (MutSβ) узнает длинные «инделы»
Слайд 53Репарация ДНК (MMR)
Эксперименты по связыванию с ДНК in vitro и
репарации гетеродуплексов in vivo показали, что MMR узнает все комбинации
неспаренных оснований, кроме C:C, а также короткие <4 п.н. делеции и инсерции («инделы»)
Неправильные пары G:T and A:C и инсерции/делеции в 1 п. особенно хорошо узнаются. Эти нарушения являются наиболее частыми ошибками ДНК-полимераз
Слайд 54Репарация ДНК
Прямое исправление повреждений (Direct reversal) (2 и >)
2. Эксцизионная
репарация оснований (Base excision repair (BER)) (15)
3. Эксцизионная репарация нуклеотидов
(Nucleotides excision repair (NER)) (28)
4. Репарация неправильно спаренных нуклеотидов (Mismatch repair (MMR)) (11)
5. Синтез через повреждения (СОС-ответ) (Trans-lesion synthesis (SOS-response))
6. Репарация при помощи рекомбинации (Repair via recombination) (14)
7. Репарация двойных разрывов (Double strand break repair) (5)
Пути репарации ДНК
Слайд 55Прежде всего об остановке репликации надо сообщить
Rec A
Связывается с однонитевой
ДНК
и образует ДНК-белковые филаменты
Однонитевые участки ДНК
образуются при остановке
репликативных вилок
Участвует в
рекомбинации и индукции SOS ответа
Lex A (репрессор)
Мастер-регулятор транскрипции
генов, кодирующих участвующие
в репарации повреждений ДНК
белки (31 ген или более)
Димеры Lex A связываются с SOS боксами (20 п.н. консенсусы) в операторах генов репарации и ингибируют транскрипцию
Репарация ДНК
SOS ответ в клетках E.coli
Слайд 56Прежде всего об остановке репликации надо сообщить
Репарация ДНК
SOS ответ в
клетках E.coli
Слайд 57Репарация ДНК
SOS ответ в клетках E.coli
Активированный RecA* разрезает LexA
Слайд 58Репарация ДНК
SOS ответ в клетках E.coli
Среди прочих в ответ на
индукцию SOS-ответа синтезируется ДНК-полимераза V, способная синтезировать ДНК через повреждения
•
UmuD повергается автопротео-литическому расщеплению с образованием активного фрагмента UmuD’, который
• активирует черезблоковую полимеразу UmuC
• комплекс (UmuD’)2-UmuC называют ДНК полимераза V
• она осуществляет репликацию через AP сайты, тимидиновые димеры и ряд других повреждений
Слайд 59Репарация ДНК
SOS ответ в клетках эукариот
В эукариотических клетках система синтеза
ДНК через повреждения активируется в остановившейся репликативной вилке моноубиквитинированием PCNA
Слайд 60АР сайты
(встраивает А)
Эукариотические ДНК полимеразы
Слайд 61Различные системы репарации могут до известной степени заменять друг друга
Слайд 62Репарация ДНК
Еще один способ обхода препятствия – посредством смены матричных
цепей (продолжение репликации с сохранением ошибки в одной из родительских
цепей
Слайд 63Репарация ДНК
Прямое исправление повреждений (Direct reversal) (2 и >)
2. Эксцизионная
репарация оснований (Base excision repair (BER)) (15)
3. Эксцизионная репарация нуклеотидов
(Nucleotides excision repair (NER)) (28)
4. Репарация неправильно спаренных нуклеотидов (Mismatch repair (MMR)) (11)
5. Синтез через повреждения (СОС-ответ) (Trans-lesion synthesis (SOS-response))
6. Репарация при помощи рекомбинации (Repair via recombination) (14)
7. Репарация двойных разрывов (Double strand break repair) (5)
Пути репарации ДНК
Слайд 64Репарации при помощи рекомбинации
Репарация ДНК
Для репарации двунитевых разрывов с использованием
системы гомологичной рекомбинации необходимы
Донор гомологии
(например гомологичная хромосома или сестринская
хроматида)
Белок, облегчающий инвазию цепи, и другие компоненты системы
гомологичной рекомбинации
Слайд 65Репарация ДНК
Репарации при помощи рекомбинации
Слайд 66Репарации при помощи рекомбинации
Репарация ДНК
5’GCTGGTGG3’
3’CGACCACC5’
до 10 000 п.н.
Слайд 67Репарации при помощи рекомбинации
Репарация ДНК
Слайд 68Репарации при помощи рекомбинации
Репарация ДНК
Слайд 69Репарации при помощи рекомбинации
Репарация ДНК
Слайд 70Репарация ДНК
Прямое исправление повреждений (Direct reversal) (2 и >)
2. Эксцизионная
репарация оснований (Base excision repair (BER)) (15)
3. Эксцизионная репарация нуклеотидов
(Nucleotides excision repair (NER)) (28)
4. Репарация неправильно спаренных нуклеотидов (Mismatch repair (MMR)) (11)
5. Синтез через повреждения (СОС-ответ) (Trans-lesion synthesis (SOS-response))
6. Репарация при помощи рекомбинации (Repair via recombination) (14)
7. Репарация двойных разрывов (Double strand break repair) (5)
Пути репарации ДНК
Слайд 71Репарация двунитевых разрывов
Существует два основных пути репарации двунитевых разрывов:
• гомологичная
рекомбинация
• негомологичное соединение концов ДНК
Двунитевые разрывы в ДНК возникают:
•
под действием ионизирующего излучения
• под действием некоторых химических агентов, в частности, ингибиторов ДНК топоизомеразы II
Слайд 72Репарация двунитевых разрывов
Выбор пути определяется, в том числе, процессингом концов.
Удаление даже нескольких нуклеотидов подавляет NHEJ.
Cdk 1, которая отключается в
G1-фазе и активна в S и G2 фазах,
фосфорилирует нуклеазу Sae2, которая запускает подравнивание концов
Слайд 73Репарация двунитевых разрывов
Негомологичное соединение концов ДНК
Распознавание двунитевого разрыва гетеродимерным белком
Ku70/Ku80 –детектором разрыва и платформой для сборки комплекса
ДНК-зависимая протеинкиназа DNA-PK
аутофосфорилируется и фосфорилирует ряд белков, необходимых далее
Слайд 74Репарация двунитевых разрывов
Негомологичное соединение концов ДНК
Обработка концов разрыва для создания
свободных 3'-гидроксильной и 5'-фосфатной групп (нуклеазы)
Слайд 75Репарация двунитевых разрывов
Негомологичное соединение концов ДНК
Восстановление двуцепочечной структуры ДНК (полимеразы
лямбда и мю)
Лигирование (ДНК-лигаза IV и кофактор XRCC4)
Слайд 76Репарации двунитевых разрывов
Репарация ДНК
Слайд 79Репарация ДНК
GG-NER в эукариотических клетках
Слайд 80Репарация ДНК
GG-NER в эукариотических клетках
Слайд 81Репарация ДНК
TC-NER в эукариотических клетках
Слайд 82Репарация ДНК
TC-NER в эукариотических клетках
