1 Система комплемента как часть иммунной системы Мария Гуревич Кафедра

биологии и биологии развития
Лаб. Проф. Цви Фишельзона

Pathway
CTLs
NK
Neutrophils
Monocytes
Eosinophils
C
C
C

сыворотки, чувствительная к высоким температурам и дополняющая функции антитела в

процессе разрушения бактерий. Подобная активность была признана «дополняющей», «комплементирующей»; отсюда и название

На сегодняшний день известны более 30 белков, составляющих систему комплемента, часть из которых растворимые и часть мембранальные, функционирующие в качестве отлаженной системы защиты организма, являющиеся частью как врождённого так и приобретённого иммунитета

Белки комплемента составляют систему, которая узнаёт, связывает и ликвидирует патогенных агентов и чужеродные клетки с высокой эффективностью и специфичностью

паразитов, вирусов
Опсонизация комплексов антиген-антитело с помощью продуктов расщепления

комплемента (C3b/iC3b/C4b) с целью последующего фагоцитоза
Immune clearance – удаление иммунных комплексов из циркуляции
Активация воспалительных процессов с помощью продуктов расщепления комплемента (анафилотоксины). Хемотаксис лейкоцитов, нейтрофилов.
Дегрануляция тучных клеток и базофилов (освобождение гистамина)
Регуляция деятельности B клеток (производство антител, селекция внутри селезёнки)
Активация T клеток
Апоптоз: *Удаление апоптотических клеток (C1q)
*про- и анти-апоптотические функции комплемента

гепатоцитами печени, а также кровяными моноцитами, макрофагами и эпителиальными клетками

желудочно-кишечного и мочевого трактов
Компоненты комплемента составляют 15% от фракции всех глобулинов в сыворотке и циркулируют в ней, находясь в инертной неактивной форме
Большая часть белков являются протеазами, которые проходят активацию после расщепления активированная протеаза расщепляет последующий белок и так далее
Существуют три отличных друг от друга пути, через которые происходит активация комплемента на поверхности микроорганизмов:
*классический (classical)
*альтернативный (alternative)
*лектиновый (lectin)

завершает которые образование С3 конвертазы, которая расщепляет С3 на С3b

и С3а.
Образование С3 конвертазы - место встречи всех трёх путей комплемента и начала основных эффекторных функций.
С3b привязывается ковалентно к поверхности бактерий и опсонизирует их, в результате чего фагоциты могут их «проглотить».
С3а - пептид, который является посредником воспалительных реакций. С5b и С5а появляются в результате расщепления С5 с помощью С5 конвертазы.
С5а также является сильным посредником воспалений. С5b приводит в действие поздние события, в результате конечные компоненты собираются в комплекс атакующий мембрану, способный разрушить мембрану бактерии.

рецепторы и вызывают локальные воспаления.
Если производятся в больших кол-вах,

либо впрыскиваемые системно, вызывают общий коллапс циркуляции, похожий на шок синдром, напоминающий системную аллергическую реакцию которая затрагивает IgE анафилактический шок.
Из всех 3 наиболее устойчивым является С5а, он обладает самой высокой специфической биологической активностью.

Все 3 вызывают сокращение гладкой мускулатуры, увеличение сосудистой проницаемости, но С5а и С3а также действуют на эндотелиальные клетки кровяных сосудов и индуцируют выражение молекул адгезии.
С3а и С5а могут активировать тучные клетки, вызывая высвобождение гистамина.

мембрану приводят к повреждению клеточной мембраны, разбуханию клетки и, в

итоге, к осмотическому лизису клетки

al. J. Immunol. 147: 212, 1991

Bollinger, 1991)
Asthma (Regal et al., 1993)
ARDS (Robbins et al. 1987)
Arthus

reaction (Szalai et al., 2000)
Bullos pemphigoid (Liu et al. 1995)
Burn injuries (Gallinaro et al, 1992)
Crohn’s disease (Ahrenstedt et al., 1990)
EAE (Davoust et al., 1999)
EAN (Vriesendorp et al., 1995)
Forssman shock (Higgins et al., 1997)
Glomerulonephritis (Couser et al., 1985)
Haemolytic anemia (Schreiber and Frank, 1972)
Hemodialysis (Amadori et al., 1983)

Hereditory angioedema (Gadek et al., 1980)
Ischemia/reperfusion injuries (Kilgore et al., 1994; Weiser et al., 1996)
IC-induced vasculitis (Cochrane, 1984)
Multiple system organ failure (Heideman and Hugli, 1984)
Multiple sclerosis (Williams et al., 1994)
Myasthenia gravis (Piddlesden et al., 1996)
Post-CBP inflammation (Pekna et al., 1993)
Psoriasis (Rosenberg et al., 1990)
Rheumatoid arthritis (Wang et al., 1995)
Septic shock (Hack et al., 1992)
SLE (Buyon et al., 1992)
Stroke (Huang et al., 1999
Vascular leak syndrome (Hack et al., 1994)
Xenotransplantation (Dalmasso, 1992)

(Vitronectin), Clusterin (SP40,40), C1INH

Membrane complement regulatory proteins:

Complement receptor-1 (CR1, CD35)
Decay

accelerating factor (DAF, CD55)
Membrane cofactor protein (MCP, CD46)
CD59-Protectin

Регуляция системы комплемента

al., 1999, Mol Imm

однозначных доказательств анти-раковых функций показано не было.
В опытах произведенных на

мышах лишенных иммунной системы, которым были внедрены человеческие опухолевые клетки, и были использованы антитела против этих клеток, было показано прямое участие комплемента в их уничтожении.
Маннан - связывающий белок (MBP) узнаёт и связывается с олигосахаридами на поверхности клеток human colorectal carcinoma.
Рекомбинантный вирус вакцинии, несущий ген MBP обладает ингибирующей рост активностью, как было продемонстрировано на клетках human colorectal carcinoma, которые были трансплантированы мышам, лишённым иммунной системы.

Complement resistance of tumor cells: basal and induced mechanisms Fishelson et al., 1999, Mol Imm

чувствительности к комплементу, эти различия принято приписывать к различным механизмам

защиты, которая производится с помощью регуляторов комплемента.
Механизмы, ответственные за устойчивость клетки к комплементу принято делить на 2 вида: основной и индуцируемый
основной - конститутивный, постоянно экспрессируемые белки как мембранальные так и секретируемые
индуцируемый - приходит в действие после стимуляции клеток с помощью цитокинов, гормонов, лекарственных препаратов или же дозами комплемента, которые не являются литическими.

Complement resistance of tumor cells: basal and induced mechanisms Fishelson et al., 1999, Mol Imm

resistance of tumor cells: basal and induced mechanisms Fishelson et

al., 1999, Mol Imm

Основные механизмы устойчивости к комплементу:
I. экспрессия мембранальных белков-регуляторов

basal and induced mechanisms Fishelson et al., 1999, Mol Imm
CD35=CR1

- является кофактором в расщеплении C3b и C4b, а также усиливает распад C3/C5 конвертаз.

CD46, CD55 - контролируют каскад комплемента на уровне С3, таким образом не давая возможности образоваться анафилотоксинам, а также МАК.

basal and induced mechanisms Fishelson et al., 1999, Mol Imm
CD59

- связывается с конечными белками комплемента (С8 и С9) и не позволяет возникновения МАК.

up of the Membrane Attack Complex
Complement resistance of tumor cells:

basal and inducedmechanisms Fishelson et al., 1999, Mol Imm

уровень их экспрессии даже в одних и тех же тканях

очень отличаются.

На многих опухолевых тканях была продемонстрирована экспрессия CD46, CD55, CD59. Более того, многочисленные исследования показали, что эти белки выражены в больших количествах, чем на нормальных клетках, т.е речь идёт о over expression.

В клеточных линиях рака лёгких экспрессия CD55, CD46 и соответственно устойчивость к комплементу выше чем в нормальных клетках тех же тканей.

Complement resistance of tumor cells: basal and induced mechanisms Fishelson et al., 1999, Mol Imm

erythrocytes. Cells were treated first with
MAbs: (A) anti-CD35, (B) anti-CD46,

(C) anti-CD55, or (D) anti-CD59, followed by FITC-labeled goat anti-mouse IgG.

A

B

C

D

A

B

C

D

K562 ERYTHROLEUKEMIC CELLS ARE EQUIPPED WITH MULTIPLE
MECHANISMS OF RESISTANCE TO LYSIS BY COMPLEMENT

с помощью экспериментов с блокированием этих белков.

Нейтрализация mCRPs с

помощью специфических моноклональных антител усилила лизис лейкемических клеток, а также желудочно-кишечных клеток и меланоцитов.

Наиболее резко выраженный эффект на лизис наблюдался в результате блокирования CD59.

Complement resistance of tumor cells: basal and induced mechanisms Fishelson et al., 1999, Mol Imm

Blocking of mCRPs

complement-mediated cell lysis. Cells were treated with rabbit anti-K562 antiserum

in combination with anti-CD59 (BRIC229), anti-CD55 (BRIC110 1 BRIC216) or anti-CD46 (GB24)
(10 mg/ml each) IgG and incubated at 37°C with NHS (1:10). Lysis was measured as percent release of TDA-forming fluorescent complexes with Eu31. Results are presented as means 6 SD of triplicates of 1 (out of 4) representative experiment.

Blocking of mCRPs

комплементу может вызвать удаление МАК с помощью экзо- и эндоцитоза
(II)

- увеличение экспреcии мембранальных регуляторов

(III) - увеличение секреции растворимых ингибиторов комплемента

(A)- формиромание МАК на поверхности

(B) - связывание цитокинов, гормонов

МАК.
Для того чтобы лизировать клетки обладающими ядрами, есть необходимость в

большом количестве каналов МАК, тогда как лизис безядерных клеток например эритроцитов, требует всего лишь один функциональный канал.
Внедрение сублитического кол-ва МАК в клеточную мембрану как нормальных как и опухолевых клеток вызывает разнообразие биологических эффектов таких как:
высвобождение реактивных кислородных метаболитов
секрецию про-воспалительных медиаторов
вход в клеточный цикл
устойчивость к апоптозу
увеличение устойчивости к комплементу.

Этот феномен называемый «индуцируемая комплементом защита» = “induced complement protection”, требует полного формирования МАК, синтеза белков и РНК и свободного внеклеточного кальция.

Induced Complement Protection
Reiter Y., 1992, Eur.J.Immun

лизиса комплементом с помощью обработки с гормоном лейкорегулин, либо с

белками формирующими поры такими как: перфорин, мелитин, экзотоксин стрептококка стрептолизин О.
Сублитический комплемент, в свою очередь, вызывает устойчивость к лизису перфорином в К562 клетках. Переход в стадию повышенной устойчивости требует приток кальция, активацию цитоплазматической PKC и каскада MAPK также как и синтез белков.
В первую очередь происходит увеличение кол-ва внутриклеточного кальция, происходит это за счёт того, что внеклеточный кальций проникает внутрь клеток, предположительно через каналы МАК.
Если увеличение кальция ингибируется с помощью устранения внеклеточного кальция - удаление МАК с клеточной поверхности также ингибируется и лизис комплементом усиливается. Из чего можно сделать вывод, что увеличение кальция необходимо для индукции устойчивости.
Важность PKC и MAPK была также показана с помощью использования ингибиторов их активности. Их использование увеличило чувствительность клеток К562 к комплементу.

Induced Complement Protection

механизм, который убирает МАК с поверхности клеток с помощью везикуляции

или интернализации.

Клетки, поврежденные комплементом или другими белками формирующими поры, страдают от большого кол-ва повреждений в
многочисленных клеточных органеллах.

Им требуется активация одного и больше механизмов для восстановления. В итоге способность опухолевых клеток приводить в действие эти механизмы и решает выживет ли клетка атаку комплементом или нет.

Опухолевые клетки снабжены большим кол-вом различных механизмов, которые придают им комплемент - устойчивый фенотип.

Заключение:

protection from complement-mediated lysis

D. Pilzer and Z. Fishelson, 2005, Inter

Imm

Normal Human Sera

protection
from complement-mediated lysis. D. Piltzer and Z. Fishelson, 2005, Inter

imm

Результаты:

trafficking
P53 inactivation
Chaperone
Plasma membrane
IL-1 receptor internalization
Stress response
Antigen processing
Cell proliferation

and differentiation

Tumorigenesis

treated with sub-lytic complement (anti-K562 Ab+NHS/HI-NHS)
SDS-PAGE of the supernatants
75kDa
Anti-mortalin
Pre-bleed
Western Blot

with anti-Mortalin rabbit Abs and pre-bleed rabbit sera

sub-lytic complement
Sedimentation at 5000Xg (removal of cell debris)
Centrifugation at 100,

000Xg (spin down of small vesicles)

SDS-PAGE of high-speed pellet and supernatants

Western Blot with anti-Mortalin or anti-C9 Abs

*Pretreatment of supernatants with triton-x100 (1% or 0.1%)

* optional

with anti-C9 antibodies indicated that both mortalin and C9 released

from K562 cells treated with sub-lytic complement could be spun down at 100,000 x g. Pre-treatment of the supernatants with 0.1% Triton-X100, prior to the high-speed centrifugation, resulted in translocation of both mortalin and C9 from the pellet to thesupernatant probably due to solubilization of the membrane vesicles bearing mortalin and C9.

complement attack
NHS + NRS
HI + NRS
Confocal microscopy -

10’ after sub-lytic attack

HI +
anti-mortalin

cells’ protection against complement
K562 cells treated with anti-K562
Treatment with anti-Mortalin

Ab

(30’ 4°C)

Treatment with NHS or HI-NHS

(60’ 37°C)

Count cell lysis (Trypan blue exclusion)

Gancz and Zvi Fishelson, Eur.J.Immun, 2004

тема мало изучена.
Апоптотические клетки могут активировать комплемент и связываться с

C1q, C3b и MBL.
Существует предположение, что белки комплемента ведут себя как опсонины, помечая апоптотические клетки для ликвидации фагоцитами. Это предположение подтвердилось с помощью использования мышей C1q knock-out которые показали уменьшение способности убирать апоптотические клетки.
Эта работа демонстрирует, что ранние апоптотические клетки, обработанные комплементом, проходят очень эффективный лизис.
Также показано, что повышенная чувствительность апоптотических клеток к лизису комплементом зависит от активации каспаз.

Apoptosis & complement

ранними апоптотическими клетками и системой комплемента
Эксперимент:
Jurkat T lymphoma cells

treated with anti-Fas Ab for 1 h in 37C

Treated with rabbit anti-Jurkat Ab 30’ on ice

Treated with NHS 60’ in 37C

Lysis determined with 51Cr release assay

комплементом, чем клетки не обработанные anti-Fas Ab вызывающим апоптоз.
Ранние апопторические

клетки чувствительны к лизису комплементом

Results:

проверить участвуют ли каспазы к лизисе ранних апоптотических клеток
Эксперимент:

Jurkat cells treated with caspase inhibitor zVAD 30’ 37C

Jurkat cells treated with anti-Fas Ab 1h 37C

Treated with anti-Jurkat Ab and NHS

Lysis determined with 51Cr release assay

10 uM частично уменьшили гибель клеток, прошедших обработку anti-Fas Ab

тогда как 50 uM полностью блокировали увеличенную чувствительность ранних апоптотических клеток к лизису комплементом.

Results:

Bcl-2 хорошо известны. Этот белок относится к Bcl-2 family и

играет очень важную роль в процессе апоптоза, обладает анти-апоптотическими функциями.

Цель: проверить влияние over-expression Bcl-2 в клетках Jurkat на их чувствительность к лизису комплементом.

Эксперимент:

Jurkat cells transfected with Bcl-2

Treated with rabbit anti-Jurkat Ab 30’ on ice and NHS 60’ in 37C

Percentage of lysis was determined by 51Cr release

прямая связь между over-expression Bcl-2 в трансфецированных клетках и устойчивостью

этих клеток к лизису. Контрольный вектор pEB37 показал, что клетки его содержащие наиболее чувствительны к лизису, тогда как остальные трасфектанты показали пониженную чувствительность.
В клетках Jurkat Bcl-2 играет роль защитника от лизиса комплементом.