20 лет назад потерял руку. Врач посоветовал биоинженерию. Рука выросла за 3

за 3 года. Чтобы проверить, действительно ли ДНК помогла или

я такой регенерирующий, я похитил трёх жителей нашего города, отрубил одному руку, второму - ногу, а третьему - голову. И начал кормить их ДНК. С третьим возникли проблемы, потому что орального отверстия не было.

Сергей Л., Малые Вяземы.

ПЫТЛИВЫЙ УМ – ДЛЯ БИОИНЖЕНЕРА ПЕРВОЕ ДЕЛО!

БИОИНЖЕНЕРИЯ №7

одной биоинженерной эпохи в другую.
Первая биоинженерная эпоха: работа с генами
Что

научились делать биоинженеры за время первой эпохи?

«вынимать» ДНК из клетки – выделение и очистка нуклеиновых кислот,
видеть ДНК глазами – электрофорез,
«вынимать» нужные участки из ДНК - рестрикция,
соединять несколько участков ДНК в один - лигирование, клонирование,
«засовывать» ДНК в клетку - трансформация,
многократно увеличивать количество нужного участка ДНК - ПЦР,
определять нуклеотидную последовательность нужного участка ДНК – секвенирование.

сегодняшнему дню научились делать биоинженеры за время второй эпохи?

определять нуклеотидную

последовательность целых геномов – высокопроизводительное секвенирование,
вносить изменения в гены прямо в живой клетке, на уровне целого генома – редактирование генома.


Мало, скажете вы? Да ничего подобного, это просто-таки революция в науке. На следующих лекциях поймете, почему.


Ну а пока останемся на время в первой эпохе и поговорим о секвенировании генов, а не геномов.

действием различных химических агентов ДНК можно расщепить по G, A/G,

C и C/T.

Образец нужно разделить на 4 части и подвергнуть каждую из частей действию только одного агента.

Концентрации химических агентов подбираются так, чтобы каждая реакция приводила только к одному разрыву цепочки ДНК.

ДНК должна быть мечена по одному концу.

Продукты реакции наносятся на ПААГ, гель подвергается авторадиографии.

добавив меченные нуклеотиды (матричный синтез).

Выступающий 3’-конец – можно пометить терминальной

трансферазой, опять же в присутствии меченных нуклеотидов (нематричный синтез).

Тупые концы – тоже годится терминальная трансфераза.



Проблему мечения обоих концов ДНК обычно решали рестрикцией:

Максама-Гилберта.

Основа данного метода – дидезоксинуклеотиды.
Если дидезоксинуклеотидтрифосфат (ddNTP) включился в цепочку

ДНК в ходе матричного синтеза, этот самый синтез на нем и закончится – у ddNTP нет 3’-концевой гидроксильной группы, необходимой для формирования фосфодиэфирной связи в ходе полимеризации ДНК.

Если организовать достройку второй цепи ДНК с меченного праймера в присутствии полного набора dNTPs и одного ddNTP с правильно подобранной концентрацией, вы получите набор меченных фрагментов ДНК, заканчивающихся на все имевшиеся в матричной цепи нуклеотиды, комплементарные данному ddNTP.

фосфатазой (АР). Она откусит пирофосфат у 5’-концевого нуклеотида.
(Сейчас-то олиги синтезируют

сразу без фосфата на 5’-конце).

2. Обработайте дефосфорилированный олигонуклеотид Т4-полинуклеотидкиназой (T4 PNK) в присутствии меченного по гамма-положению дАТФ. Меченный фосфат перейдет на 5’-конец олигонуклеотида.

3. Очистите олигонуклеотид от низкомолекулярных соединений, содержащих метку (продукты деградации, сам дАТФ).

4. …

5. PROFIT!!!

ddNTP, нанесите результат на ПААГ, радиоавтографируйте гель и…

не больше 100 нуклеотидов.

Максама-Гилберта был очень быстро вытеснен методом Сэнгера. Максам-Гилберт остался только

лишь для тех случаев, когда ДНК-полимераза, используемая в процессе по Сэнгеру, не могла пройти сложные вторичные структуры ДНК (псевдоузлы и т.п.).



А теперь прошу обратить внимание на столбец «возможность автоматизации».

реакция в одной пробирке

Капиллярный электрофорез => более 1000 нуклеотидов за

одно прочтение

пишет соответствующую нуклеотидную последовательность.
Очень удобно!
Секвенирование по Сэнгеру применяется до

сих пор для решения всех задач, не связанных с анализами геномного уровня.

методов секвенирования, объединенных следующими свойствами (в сравнении с методом Сэнгера):

Упрощение

приборной базы (для конечного пользователя, если говорить о принципах работы – то, безусловно, усложнение)

Удешевление процесса,

Увеличение эффективности чтения ДНК (возможность читать более длинные фрагменты или же читать ДНК быстрее),

Более высокая степень автоматизации процесса.

И мы наконец переходим во вторую биоинженерную эпоху!

присоединении каждого нового нуклеотида к растущей цепи ДНК в ходе

ПЦР.

Длина одного рида: до 500 нуклеотидов, в современных приборах чаще до 100.

Используется, в основном, для ресеквенирования, то есть для повторного секвенирования геномов, прочтенных другими методами. Помимо этого, применяется для генотипирования и для определения статуса метилирования ДНК.

Являлось первой по времени технологией NGS, первоначально использовалось и для первичного секвенирования. По сравнению с методом Сэнгера (поскольку тогда сравнивать больше было не с чем) метод был фееричен.

Основное достоинство: высокая точность.

Основной недостаток: высокая длительность анализа по сравнению с другими технологиями NGS.

Первый прибор: компания 454 Life Sciences, 2005 год.

на две комплементарные цепи.
Одноцепочечные молекулы ДНК прикрепляются к бусинкам в условиях, стимулирующих попадание

лишь одной молекулы на бусинку. Отдельные бусинки заключаются в капли реакционной смеси, окруженные маслом. Количество молекул на бусинке увеличивается в миллионы раз в результате эмульсионной полимеразной цепной реакции (эПЦР).

на своей поверхности миллионы одноцепочечных копий первоначального фрагмента ДНК, помещаются в лунки

оптико-волоконного слайда, по одной в каждую лунку.

В каждую лунку добавляются бусинки поменьше, несущие на своей поверхности ферменты и другие молекулы, необходимые для пиросеквенирования.

добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он комплементарен соответствующему

нуклеотиду матрицы ДНК. Каждое присоединение к цепи сопровождается выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимолярном количеству встроившихся нуклеотидов.

АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5’- фосфосульфата.

Люцифераза запускает АТФ-опосредованную реакцию окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ.

В течение всей реакции апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, не встроившихся в цепь ДНК, добавляется новый нуклеотид.

раза выше обычного – два одинаковых нуклеотида подряд.
Отсюда вытекает

еще один существенный недостаток данной технологии: неспособность определять последовательности, состоящие из много раз повторенных одинаковых нуклеотидов (гомоолигомерные участки ДНК). Таких участков в геномах полно.

назвать Sequencing by Synthesis. Его принцип очень похож на принцип

пиросеквенирования, только детектируется не свет, а протоны, то есть изменение рН.

Длина одного рида: до 400 нуклеотидов, в современных приборах чаще до 200.

Используется для всех возможных задач NGS, но только если геном не очень большой. На большие геномы метода не хватает.

Основное достоинство: относительно низкая цена, быстрота.

Основной недостаток: невысокая точность прочтения гомополимерных участков, невысокая производительность.

Первый прибор: компания Ion Torrent Systems, 2010 год.

dNTP по очереди. Когда какой-то нуклеотид присоединился – выделяется протон,

который тут же регистрируется сверхчувствительным детектором.

при лигировании олигонуклеотида к секвенируемой цепи ДНК.

Длина одного рида: до

75 нуклеотидов.

Широко использовался для всех задач, связанных с секвенированием. В настоящее время (c 2016 года) поддержка технологии основными игроками на рынке прекращена, то есть технология не выдержала конкуренции.

Основное достоинство: высокая точность.

Основной недостаток: слишком короткие риды.

Первый прибор: SOLiD от компании Applied Biosystems, 2006 год.

адаптеров
Распределение фрагментов ДНК по магнитным бусинам
Эмульсионная ПЦР
По окончании эПЦР все

3’-концы амплифицированных фрагментов ДНК специальным образом модифицируются…

ячейках.
В ячейки сначала добавляется обычный олигонуклеотид, комплементарный адаптеру, который использовался

для эПЦР. После этого добавляется смесь хитрых олигонуклеотидов, меченных четырьмя разными флюорофорами, длиной 8 нуклеотидов каждый:

X-Y-n-n-n-Z-Z-Z-флюорофор

X, Y – два каких-то конкретных нуклеотида,
n – вырожденный нуклеотид (любой из четырех),
Z – некое производное нуклеотида, которое не может никуда отжечься (что это такое именно – производители не раскрывают, скорее всего инозин).

предпочтительно будут отжигаться те, которые максимально комплементарны секвенируемой ДНК, то

есть те, у которых X и Y комплементарны двум нуклеотидам ДНК, следующим сразу после адаптера.
Напоминаю: нуклеотиды n вырожденные, они в любом случае отожгутся.
Добавьте ДНК-лигазу – и она сошьет связавшийся с ДНК хитрый олиг с универсальным.



Отмойте все, что не связалось и не лигировалось, и детектируйте флюоресценцию.

X-Y-n-n-n-Z-Z-Z-флюорофор

олигонуклеотиду и находятся в составе дуплекса с секвенируемой ДНК. Для

Z-Z-Z второе неверно – они висят наружу, так как изначально не могли никуда отжечься. Добавьте специальное «режущее вещество», и оно (1) отрежет Z-Z-Z вместе с флюорофором и (2) оставит 5’-концевой фосфат на части олигонуклеотида в составе дуплекса.
«Режущее вещество» производителями не раскрывается, скорее всего – соль серебра.

X-Y-n-n-n-Z-Z-Z-флюорофор

Повторите всю процедуру сначала!

В результате вы будете знать каждые два нуклеотида из пяти, то есть нуклеотиды в положениях 1, 2, 6, 7, 11, 12 и т.д.

с нее все, что там отожглось и лигировалось, а затем

отожгите на нее новый универсальный праймер. Если принять положение, на котором кончался предыдущий, за n, то новый должен кончаться на n-1, то есть быть на один нуклеотид ближе к 5’-концу секвенируемой молекулы.




Повторите все сначала – и у вас определятся уже другие пары нуклеотидов! Для предыдущего универсального олига на первом шаге определялись нуклеотиды n+1 и n+2, а для этого – n и n+1.

процедуры у вас за несколько циклов лигирования получается информация о

каждом нуклеотиде, причем ДВАЖДЫ!


Но только это еще не конец. Самых внимательных из вас могло смутить вот что:
«… смесь хитрых олигонуклеотидов, меченных четырьмя разными флюорофорами, длиной 8 нуклеотидов каждый…»

Ну-ка, ребятки, кому кажется, что здесь что-то не так?

То есть выходит, что каждый флюорофор соответствует четырем динуклеотидам! Здесь

же нет однозначного соответствия!


Какое тут вообще к свиням секвенирование?!

АТ

положении n-1! Это же последний нуклеотид универсального олига! И при

этом вы его отсеквенировали в составе пары n-1/n, и эта пара дала вам, допустим, зеленый цвет. И вы знаете, что n-1 – это G. Значит, n – это T! А пара n/n+1 дала вам желтый цвет. Значит, n+1 – это А!

И так далее.

АТ