БИОИНЖЕНЕРИЯ № 6 Неконтролируемое размножение генно-модифицированных деревьев

важнейший процесс для развития и нормального существования любого многоклеточного организма.
Да

и одноклеточного тоже – при помощи ДЭГ они приспосабливаются к меняющимся условиям среды.

вам нравится больше?

финальный продукт экспрессии генов.
Но возникает вопрос: как посчитать количество белка?

Ответ на него очень простой: практически никак.
Есть метод Вестерн-блот гибридизации, основанный на использовании специфических антител, но этот метод не совсем количественный.
Есть винтажные способы точного подсчета количества белка, но они очень трудоемкие.

Так что все считают по РНК.

очень стабильная, и выделить ее из клетки в большом количестве

нельзя.

Вас же интересует в основном мРНК.
А в клетке подавляющее большинство РНК – это рибосомные РНК.

Здесь на помощь биоинженерам приходит
обратная транскрипция!

cDNA), то есть ДНК, являющейся точной копией зрелой мРНК. Часто

это бывает необходимо, чтобы избежать проблем, связанных с процессингом РНК (сплайсинг и т.п.).

ПОМНИШЬ ЭТУ СХЕМУ?!

количество РНК
(>100 мкг).
• Популяция кДНК обеднена 5’-последовательностями - обратная

транскриптаза часто не доводит синтез до конца.
• На 5’-конце первой цепи кДНК нет последовательности, к которой можно было бы подобрать универсальный праймер для амплификации.
Так не годится, нужно что-то придумать!

матричной РНК

фосфатаза, убирает фосфат с 5’-конца РНК.
ТАР – вирусная кислая пиро-фосфатаза,

отрезает кэп-структуру, остается фосфат.
5’-адапторный праймер может лигироваться только с РНК, у которых на 5’-конце есть фосфат, то есть с теми, которые были кэпированы, то есть с полноразмерными мРНК!

Изначально в смеси есть разные РНК, но только полноразмерные мРНК содержат кэп-структуру.

навешивает несколько дополнительных нуклеотидов на 3’-конец после окончания матрицы (чаще

всего С).

Используются два адапторных праймера – один с олигоТ, другой с олигорибоG (адапторные последовательности разные!)

…кроме проблемы «обрывочных» мРНК с неправильным 5’-концом. Эта проблема сейчас решается качественным и аккуратным выделением мРНК, при котором они не рвутся.

экспрессию генов смотреть.
Этот человек как бы спрашивает нас:
Как считать-то будем?

до начала эпохи NGS.
Подготовьте библиотеку кДНК, клонируйте ее в вектор
Отсеквенируйте

всю библиотеку, но каждый клон прочтите только один раз с какого-нибудь из концов.
У вас получится набор ридов длиной 100-800 нуклеотидов каждый. Каждый такой рид и есть EST, и он представляет собой часть последовательности какой-то мРНК.
Проведите анализ результатов . Как именно – объяснять не буду, это сложно и к биоинженерии отношение имеет косвенное*.

Пока было известно мало полных геномов, метод EST позволял быстро и достоверно получать информацию о ранее неизвестных белковых генах.

Этим, в сущности, он и был силен. Сейчас он используется редко, только если люди работают с экзотическими организмами с неизвестным геномом и у них не хватает денег на полногеномное секвенирование.

Про современный анализ экспрессии генов при помощи NGS я расскажу как-нибудь потом, при случае.

*На самом деле, я и сам до конца не понимаю, как их анализируют.

не знаем
1. Радиоактивноcть
А) Связывание кДНК со специальными мембранами (нитроцеллюлоза, нейлон)
Первичное

связывание происходит электростатически.

Затем специальной обработкой (УФ-свет, нагревание) можно превратить электростатические связи в ковалентные
(cross-linking).

по принципу комплементарности.
Саузерн-блот гибридизация (ДНК-ДНК)
«Дот»-вариант
(образцы капаются на мембрану, фиксируются, и

мембрана инкубируется с растворо меченного зонда).

Вариант с электрофорезом (ДНК сначала разделяется в геле, затем переносится с геля на мембрану под действием тока, а уж потом мембрана инкубируется с растворо меченного зонда).

= 1 - 2

пришейте его к стрептавидин-сефарозе.
Синтезируйте кДНК.
Проведите рестрикцию часто щепящей рестриктазой. Она

называется Anchoring Enzyme (AE), чаще всего используют NlaIII.
Разделите стрептавидин-сефарозу на две равные части.
Проведите дизайн двух адаптеров: они должны содержать сайт рестрикции для фермента, который режет на удалении 14-15 нуклеотидов от участка узнавания. Эту рестриктазу называют Tagging Enzyme (TE), чаще всего используется BmsF1.
Лигируйте адаптеры к тем кускам дуплекса ДНК-РНК, которые остались висеть на сефарозе.

молекулярной биологии

рестрикции (а) не будут прикреплены к стрептавидину, (б) будут содержать

сайт для фермента АЕ и (в) будут содержать по 14-15 нуклеотидов исходной кДНК.
Достройте липкие концы при помощи ДНК-полимеразы.
Смешайте два препарата вместе и проведите тотальное лигирование продуктов рестрикции. кДНК-участки будут лигироваться друг с другом, образуя так наываемые дитаги.
Амплифицируйте продукты лигирования, проведите рестрикцию ферментом АЕ.
У вас получатся ПЦР-продукты с липкими концами. Залигируйте их друг с другом снова, получатся гораздо более длинные молекулы, называемые конкатемерами. Клонируйте их и секвенируйте!

ее было в исходном образце!

– это некая совокупность ячеек, в каждой из которых имеется

какая-либо ДНК. С этой ДНК может гибридизоваться ДНК из анализируемых образцов. Это, в свою очередь, дает вам информацию о том, какие ДНК находятся в вашем образце.

– вот и вся недолга!
Два методологических подхода к оценке дифференциальной

экспрессии генов,
которых мы еще не знаем

Cy3 или Cy5 нуклеотиды в состав кДНК при помощи ДНК-полимеразы



Нанесите

аликвоты вашего образца в лунки микрочипов. Если у вас хороший детектор – нанесите оба образца на один чип.

друг на друга.






7. Посчитайте!

/ анаэробное)

и Cy5.

Посчитайте количество красных и зеленых пикселей в пятнах.

Разделите одно

на другое, отложите в логарифмической шкале и сравнивайте!

могут использоваться:

Фрагменты кДНК,
ПЦР-продукты,
Олигонуклеотиды.

Однако все они наносятся на чип и химически

закрепляются там уже после того, как они были синтезированы.






Технология Affymetrix подразумевает синтез олигонуклеотидов прямо на твердой поверхности (стекле).

До 10 тысяч точек на одном чипе.

До 500 тысяч точек на одном чипе.

и они закрыты «масками». Вторые «маски» светочувствительны и могут избирательно

закрывать определенные «точки связывания». Под действием света вторы«маски» уходят, но защищают собой первые. Там, где вторых «масок» не было, уходят первые «маски», и эти места становятися доступны для связывания нуклеотидов.