БИОТЕХНОЛОГИЯ

А.И. Герцена

Направление 020400 Биология
Профиль Общая биология






Профессор кафедры Зоологии д.б.н., проф. Цымбаленко Надежда Васильевна

Химически синтезированные олигонуклеотиды можно использовать:
для конструирования целых генов или

их фрагментов
для амплификации специфических фрагментов ДНК
для направленных мутаций изолированных ДНК
в качестве зондов при гибридизации
в качестве линкеров, облегчающих клонирование

фосфодиэфирных связей.

время.
Исходные строительные блоки – модифицированные дезоксирибонуклеозиды.











Модификация состоит в

присоединении к аминогруппам дезоксиаденозина и дезоксицидина бензольной группы, а к аминогруппе дезоксигуанозина – изобутиральной. Тимидин, у которого аминогруппа отсутствует, не модифицируют.

Такая модификация необходима для защиты нуклеозидов от нежелательных побочных эффектов.

четырех
оснований – A,T,G и C –
используются для химического
синтеза ДНК.
ДМТ

– диметокситритил
Ме – метильная группа

твердом носителе), что позволяет проводить все реакции в одной емкости,

легко отмывать после каждого этапа ненужные реагенты и добавлять новые в количестве, оптимальном для полного протекания реакции.
Первый нуклеозид фиксируют на твердом носителе с помощью химического спейсера. Обычно это пористые стеклянные шарики с порами одинакового размера.

Первый нуклеозид
фиксируют на твердом
носителе

с помощью
химического спейсера.
Обычно это пористые
стеклянные шарики с
порами одинакового размера.

образуется одноцепочечный фрагмент ДНК из n+1 нуклеотида.

Цикл начинается после присоединения первого нуклеозида

к стеклянному шарику
промывают безводным растворителем (ацетонитрил), остатки которого удаляют продуванием аргона
промывают ТХУ (трихлоруксусная кислота) для отщепления ДМТ (детритилирование)
опять промывают растворителем и ТХУ, продувают аргон и на этом этапе вводят следующий нуклеозид в виде фосфоримидита и тетразол, который активирует фосфорамидит, несвязавшиеся реагенты удаляют продуванием аргона.

Детритилирование — отщепление 5'-диметокситритильной  (ДМТ)

группы с помощью трихлоруксусной кислоты (ТХУ).

! Поскольку по окончании первого этапа

не все фиксированные на носителе нуклеозиды оказываются связанными с фосфорамидитом, необходимо предотвратить их взаимодействие с нуклеозидом, добавленным на втором этапе. Для этого непрореагировавшую 5’ – ОН группу ацетилируют с помощью уксусного ангидрида и диметиламинопиридина (кэппирование).

!! Нестабильную фосфиттриэфирную связь, образовавшуюся на втором этапе между нуклеотидами с помощью иодной смеси окисляют до пятивалентного фосфаттриэфира.

Все описанные операции проводят

до тех пор, пока к растущей цепи в соответствии с программой не присоединится последний нуклеозид.

!!! Метильные группы удаляют с помощью химической обработки непосредственно в реакционной колонке. Затем отсоединяют олигонуклеотиды от спейсерной молекулы вместе с 3’ –ОН концом и элюируют их из колонки; затем последовательно удаляют бензоильные, изобутиральные и ДМТ-группы. 5’ –конец цепи фосфорилируют ферментативным (полинуклеотидкиназа+АТФ) или химическим методом.

Синтез генов
Первый подход:

Синтезируют отдельные олигонуклеотиды длиной от 20 до 60 звеньев каждый. Нуклеотидные последовательности цепей задают так, чтобы после отжига концевые сегменты гена имели тупые концы. Каждый внутренний сегмент имеет выступающие 3’ – и 5’ – концы, комплементарные таковым соседнего сегмента, чтобы при отжиге из них образовалась двухцепочечная молекула. Оставшиеся одноцепочечные разрывы сшивают с помощью ДНК-лигазы Т4.

Второй подход:

Сборка протяженного гена

in vitro с участием ферментов.

Вначале химическими методами синтезируют отдельные олигонуклеотиды с такими нуклеотидными последовательностями, чтобы при отжиге между ними образовались спаренные участки длиной 6-10 пар нуклеотидов. Оставшиеся между ними бреши заполняют с помощью ДНК-полимеразы I E.coli, а одноцепочечные разрывы сшивают ДНК-лигазой Т4

Исчерпывающую информацию о молекуле ДНК можно получить, только

определив ее нуклеотидную последовательность.

Дидезоксинуклеотидный метод секвенирования ДНК
Дидезоксинуклеотид – это

полученный искусственным путем нуклеотид, лишенный 2’ – и 3’ – ОН групп при углеродных атомах сахарного кольца. При присоединении такого нуклеотида во время роста полинуклеотидной цепи синтез останавливается.

Остановка синтеза ДНК – ключевой этап дидезокси-метода,

но чтобы осуществить секвенирование в полном объеме, необходимо выполнить целый ряд условий:

1. Гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17-20 звеньев со

специфическим участком одной из цепей клонирующего вектора, соседствующим со вставкой. Этот олигонуклеотид является донором 3 – ОН для инициации синтеза.
2. Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dTTP, dCTP и dGTP (один из них – меченый),и один из четырех дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddCTP и ddGTP) в рассчитанной концентрации. После присоединения ddNTP синтез сразу останавливается. Т.о. в каждой пробирке оказывается уникальный набор олигонуклеотидов, каждый из которых содержит праймерную последовательность.

3. В пробирки добавляют формамид, чтобы обеспечить расхождение

цепей, и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках. Это позволяет разделить одноцепочечные фрагменты ДНК, даже если они различаются по длине всего на один нуклеотид. На радиоавтографе обнаруживается набор полос, отвечающих меченым фрагментам ДНК, сопоставление которых позволяет прямо “прочитать” нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК. Нуклеотидная последовательность считывается с радиоавтографа снизу вверх.

Автоматическое секвенирование

Процесс гибридизации, т.е. образования водородных

связей между основаниями нуклеотидов происходит между любыми одноцепочечными полинуклеотидами, если они комплементарны: ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК

изменения внешних условий водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся

термодинамически невыгодными и цепочки полинуклеотидов расходятся.
2. Препарат денатурированных ДНК затем смешивают с другой денатурированной ДНК, или РНК.
3. Препараты далее медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК отжигаются друг на друга (образуются водородные связи между комплементарными основаниями), при этом образуется “гибридная молекула”.

в последовательностях ДНК между видами или особями одного вида.
Гибридизация нуклеиновых

кислот представляет собой высокочувствительный метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов и применяется в различных модификациях как в растворе, так и на твердых подложках, например на нитроцеллюлозных фильтрах или нейлоновых мембранах.

Гибридизация по Саузерну (Southern)

Полимеразная цепная реакция
ПЦР–эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей.
Для ПЦР необходимы:
Два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной 20-25 нуклеотидов), комплементарные участкам ДНК из противоположных цепей, фланкирующим последовательность-мишень; их 3’ – ОН концы должны быть ороиентированы навстречу друг другу;
ДНК-мишень длиной от 100 до 35000 п.н.;
термостабильная ДНК-полимераза, которая не теряет своей активности при температуре 95 и выше;
четыре дезоксирибонуклеотида.

выдерживанием его при температуре 95 С в течение по крайней

мере 1 минуты. Помимо ДНК в реакционной смеси содержатся в избытке два праймера, термостабильная ДНК-полимераза Taq, выделенная из бактерии Termus aquaticus и четыре dNTP.
2. Ренатурация или отжиг. Температуру смеси медленно понижают до оптимальной температуры спаривания матрицы ДНК и праймеров.
3. Синтез. Температуру повышают до приблизительно 75 С – величины, оптимальной дляДНК-полимеразы Taq. Начинается синтез комплементарной цепи ДНК, инициируемый 3’ – ОН группой праймера.

После 25 циклов концентрация амплифицированных фрагментов

увеличивается в миллионы раз.
После амплификации полученные фрагменты анализируют гель-электрофорезом.
С помощью ПЦР можно вводить адапторы для создания сайтов рестрикции у амплифицированных фрагментов с дальнейшим их клонированием, например в клетках E.coli.
Этот метод используют также для направленного мутагенеза.

это семейство методик количественного ПЦР со следующими чертами:
Определение выхода продукта

реакции после каждого цикла амплификации.
Построение по этим данным кинетической кривой ПЦР.
Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой.

количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются

в зависимости от типа real-time ПЦР.
Real-time ПЦР позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

ней можно выделить три стадии:
1. Стадию инициации (когда ПЦР-продукты

еще не
детектируется флуоресцентной меткой).
2. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается
Экспоненциальная
зависимость количества
флуоресценции от цикла
ПЦР).
3. Плато –
стадию насыщения.

1. Использование интеркалирующих агентов. Этот способ

детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации.









Детекция с применением интеркалирующих красителей, таких как SYBR GreenandEvaGreen, не специфична к нуклеотидной последовательности, поскольку они связываются с любой двухцепочечной ДНК. Основное преимущества их применения – дешевизна.

Выщепление 5' концевой метки (TaqManAssay).
Эта методика

основана на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют 3 ДНК-зонда: 2, фланкирующих (немеченные), а в состав третьего входит флуоресцентная метка в 5'-положении и гаситель флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении.
Эти зонды имеют места посадки
внутри амплифицируемой области.
Гаситель поглощает испускаемое
флуоресцентной меткой излучение,
а фосфатная группа в 3'-положении
блокирует полимеразу .
Во время стадии элонгации
полимераза синтезирует
Комплементарную цепь ДНК и
при достижении зонда
начинает его расщеплять
благодаря наличию 5'-экзонуклеазной
активности. Таким образом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения.

Цифровая ПЦР (ddPCR, dropPCR) – новый

подход к детекции и определению количества нуклеиновых кислот. Это усовершенствованный метод полимеразной цепной реакции с использованием, например, системы интеркалирующих агентов или TaqManAssay . Реакционная смесь после добавления ДНК распыляется на множество мельчайших капель, попадающих на лунки чипа.
Чип может содержать несколько десятков тысяч ячеек, на которых в каплях протекает ПЦР. При проведении анализа отрицательные реакции также используются для подсчета абсолютного количества молекул-мишеней в образце.









По завершению реакции данный чип может быть использован для проведения секвенирования или клонирования с каждой капли.

транскрипция - это синтез ДНК по матрице РНК.
Обратную транскрипцию
обнаружили

в 1970 г. Темин,
Балтимор, Дульбеко,
работавшие с вирусом
саркомы Рауса (ВСР). Это
онкорнавирус (oncoRNA) –
относится к ретровирусам.

из двух полипептидных цепей, одна из которых несет экзорибонуклеазную и

5’→3’ полимеразную активность. Экзорибонуклеазная активность проявляется только в дуплексах ДНК/РНК.
Как полимераза фермент работает на однонитевых молекулах РНК и ДНК, образуя комплементарные дезоксирибонуклеотидные цепи (кДНК), для чего ему требуются праймеры с 3’ - ОН концом.

(ОТ или RT) ведут в две стадии:

1. Синтез однонитевой ДНК

на матрице мРНК с помощью праймера олиго-(dT)n либо набора случайных (random) праймеров.
2. Синтез двунитевой кДНК на матрице однонитевой кДНК, причем праймером служит 3’-ОН конец однонитевой петли, которая образуется при окончании считывания копии с мРНК обратной транскриптазой.

используемый для определения специфичных белков в образце.
На первом этапе

использует электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине (как правило, в присутствии SDS) или по трехмерной структуре белка (в нативном состоянии). Далее белки переносят на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану, затем детектируют с использованием антител, специфичных к заданному белку.

который люминесцирует после взаимодействия с репортером вторичного антитела. Свет регистрируется

фотопленкой или CCD-камерой, которая производит цифровую съемку вестерн блота. Изображение анализируется денситометрически, оценивая относительное количество окрашенного белка и даёт количественный результат в единицах оптической плотности. Новое программное обеспечение позволяет провести дальнейший анализ данных, например, определить молекулярный вес, если использовался соответствующий стандарт.

электрофорез и иммунодиффузию.