Электронное пособие для ПЗ Лабораторная диагностика зоонозных инфекции

Асколи, Хедельсона, Райта. Интерпретация результатов. (по возбудителю бруцеллеза)
Подготовила:
дмн, профессор

Рамазанова БА

подострым хроническим течением. Сопровождается лихорадкой, поражением селезенки, печени, половых органов;

нервной, сердечной и костных систем.
 1886 г. - Брюс на о. Мальта (обнаружил в селезенке умершего человека). Мальтийская лихорадка.

заболевании впервые появились в шестидесятых годах девятнадцатого столетия. Первым описал

эту болезнь британский военный медик Мэрстон. Уже через двадцать лет после первого описания появилось и второе. Его сделал также Британский военный медик Брюс, работавший на Мальте. Он провел лабораторные исследования внутренних органов пациента, умершего от этого заболевания (тогда его называли еще мальтийской лихорадкой). В селезенке был найден микроорганизм, получивший название бруцеллы. Уже через двенадцать месяцев этот выдающийся ученый сам научился выращивать бруцеллы в условиях лаборатории.

определенных условиях образуют микрокапсулу

(свиной)
B. abortus (коровий)
B. Canis (собачий)
B. Ovis (баранов)
B. Neotomae ( кустарниковых

крыс)

в эритрит-агаре в тече­ние 72 ч.
 
а-В. melitensis 16 М;

В. abortus 544;
в-В. suis Окраска по Граму. x1l50.

72 ч.
а, в-В. melitensis 16 М; б - В.

abortus 544. Иммобилизация кле­ток агаровым (а, б) и желатиновым (в) гелями. Аноптральный контраст. х1350.
По морфологии микробы довольно од­нородные и представлены кокками, ово­идами инебольшими прямыми палочка­ми (а, б, в). Протоплазма живых клеток по цвету темнее фона поля зрения и не содержит включений. Их клеточная обо­лочка на всем протяжении равномерной оптической плотности и толщины (в).
 

Контрастирование уранилацетатом. х20 000.
- поверхность клеток покрыта аморфными материалами,

интенсивно контрастируемыми уранилацетатом; б - при зна­чительном развитии такой покров напоминает капсулу .
 

000;

в, е - х80 000

с базальной мембраной пептидогликана (б, г, е), периплазма значительных (б)

и небольших размеров (В), может быть заполнена материалом высокой (б) и средней (а, г плотности по отношению к электронам или почти электронно-прозрачной (д, е). Рибосомы и полисомы плотно упа кованные (а, в). Нуклеоид представлен небольшими зонами нуклеоплазмьr (а-г). Включения располагаются в ци­топлазме (б) или пери плазме (г).
 

углубл­ение ее. В зоне деления могут распо­лагаться включения (б).
 

антигены (преобладает у B. melitensis );
Термостабильный Vi - антиген
Основные факторы

патогенности бруцелл:
Эндотоксин
Гиалуронидаза
Низкомолекулярные вещества, подавляющие фагоцитоз
адгезины

СЫВОРОТКИ КРОВИ
РОСТ ЗАМЕДЛЕН (30 СУТ), при пересевах растет быстрее
Br .

abortus НУЖДАЕТСЯ В 5-10% СО2
КОЛОНИИ МЕЛКИЕ, БЕСЦВЕТНЫЕ С ПЕРЛАМУТРОВЫМ ОТТЕНКОМ
НА ПЕЧЕНОЧНОМ БУЛЬОНЕ – МУТЬ.

а- B.melitensis 16m; б- В. abortus 544; в- B. suis

1300.
Микрофотосъемка проходящем свете. х56.
Микроколонии по внешне виду напоминают полусферу с гладкой поверхностью и ровными краями. На вершине микроколоний В. melitensis возможны округлые зоны центрального роста.

72 ч на FГ -агаре.
a- В. melitensis 16

М; б-В. abortus 544; в-В. suis 1300. Фотосъемка в падающем свете.
По форме, цвету и консистенции колонии бруцелл сопоставляемых штаммов практически не отличаются

М;
б - В. abortus 544;
в-В. suis 1300. Микрофотосъемка в

падающем свете. х13.
Независимо от ВИДОВЫХ особен­ностей бруцеллы образуют бе­лые колонии в форме полусфе­ры с ровными краями и глад­кой блестящей поверхностью, отражающей лучи света (а-в).

abortus 19 БА
Микрофотосъемка в падающем свете. х13.
По форме,

цвету, топографии поверхности и очертанию краев колонии бактерий вакцинных и виру­лентных штаммов не имеют принципиальных различий.

R-формах.
Штамм В. melitensis Rev-l.
а - поверхность агара до

окраски по методу Уайта-Уилсона,
б - после окраски. Фотосъемка в па­дающем свете.
 
После окраски R-формы колоний стали синими.

Уайта-Уилсона.
Микрофотосъемка в падающем свете. хз.
а - полное прокрашивание;
б

- частичное.
Гладкие колонии остаются белыми, а R-формы прокрашиваются полностью или частично.

ПРИМЕНЯЮТ:
1.бактериостатическое действие красок
2. потребность в СО2
3. образование сероводорода
4. РА с

монорецепторными сыворотками.

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ:
ЗНАЧИТЕЛЬНО УСТОЙЧИВЫ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ:
МОЛОКО - несколько недель
МЯСО- 20 сут
МАСЛО- до 60 дней
СЫР- до 4 недель
НА БЕЛЬЕ в выделениях- до 1 мес
В ПЫЛИ, ВОДЕ- до 2 мес
КИПЯЧЕНИЕ – мгновенно, 60оС-30 мин
к ДЕЗИНФЕКТАНТАМ – УСТОЙЧИВ.

грызуны, лаб. животные
-ЗАРАЗНЫМ ЯВЛЯЮТСЯ выделения больных животных - моча, околоплодные

воды, молоко (особенно молочные продукты), мясо.
Наиболее опасный для человека источник заражения бруцеллезом: мелкий рогатый скот, а при миграции бруцелл овечьего типа - коровы

зайцы, северный олень
B.abortus - КРС
B.canis – собаки
Наиболее патогенный для человека

вид бруцелл - B. melitensis
Вид бруцелл, который чаще вызывает бессимптомную инфекцию - B. abortus

селезенка, костный мозг, лимфатические узлы)
Длительная до года и более бактериемия
Развитие

ГЗТ
Возможность формирования бессимптомной инфекции (скрытая форма инфекции)
Хр. Течение с поражением кроветворной, нервной, половой систем, суставов.

выявления ГЗТ:
ГЗТ сохраняется в течении всего инфекционного процесса и многие

годы после его прекращения

некоторых пациентов данное заболевание протекает в острой форме, у других

возникает первично-латентная форма без клинических признаков.
Существуют еще первично и вторично - хронические метастатические формы. У больных с остросептической формой заболевания температура повышается до 40 °С, при этом , следует отметить то , что самочувствие остается хорошим.
При бруцеллезе характерны: умеренная головная боль, ломящие боли во всем теле, повышенная потли­вость. Наблюдается микрополиаденит, увеличивается печень и селезенка. Часто, при хронических формах возникают различные изменения органов. Поражаются крупные суставы (артриты, периартриты), переферическая нервная система, мышцы. Существует возможность возникновения орхоэпидимитов, эндометритов, орхитов.
Одним из самых негативных последствий, является - самопроизвольный аборт.
При бруцеллезе обострения сменяются ремиссиями, это довольно долгосрочный процесс. У некоторых пациентов происходят стойкие остаточные явления. Это резидуальный бруцеллез.
При диагностики заболевания необходимо учитывать контакт с инфицированными животными. Также немаловажное значение уделяется эпидемиологическим предпосылкам.

ПОДЪЕМ ТЕМПЕРАТУРЫ ДО 38-39С
-потливость, увеличение л/у, печени, селезенки, боли в

мышцах, суставах, в пояснице, тазовых костях, по ходу седалищного нерва
-заболевание протекает в виде ТИПИЧНОЙ ХРОН. РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ ИНФЕКЦИИ И БЕССИМПТОМНО.

людей бруцеллезом.
Иммунитет при бруцеллезе обусловлен клеточным (фагоцитоз); гуморальными (агллютинины,

комплементсвязывающие антитела) факторами, сочетается с аллергией

Специфическая профилактика бруцеллеза: вакцина бруцеллезная живая применяется по эпидпоказаниям
Вакцину против бруцеллеза используют как для вакцинации животных, так и для лечения зараженных людей
Специфическое лечение хронического бруцеллеза: бруцеллезный иммуноглобулин;
вакцина бруцеллезная лечебная (убитая)-редко
Препараты для химиотерапии: антибиотики широкого спектра действия
.

основе - меры профилактики инфекции среди животных и ликвидация

очагов эпизотии в случае их возникновения.

к бруцеллезным Аг

Выявление специфических изменений в организме
Основные методы лабораторной диагностики:
Бактериологический

(выделение гемо-, урино-, копрокультур)

Серологический

Биологический

Аллергический

материал
От животных:
Абортированные плоды
Плодные оболочки или желудок плода с его содержимым
Лимф.узлы
Влагалищные

выделения
молоко

вены,10мл, стерильно
Кровь для серологии – берут из пальца 1-2 мл
Моча-

берут стерильным катетером в стерильную посуду
Грудное молоко – собирают в стерильную посуду

СМЖ – специальной иглой в стерильную посуду

Костный мозг – стерильным шприцем в стерильную посуду

с анилиновым красителем (основной фуксин, и тионин)
Агглютинация с монорецепторными сыворотками

против А-, М-антигенов
Чувствительность к фагу
Окисление субстратов (аминокислоты, углеводы, спирты)

на стекле; Райта – пробирках)

Опсонофагоцитарная

РПГА, РСК, реакция Кумбса, ИФА

сыворотке крови больного специфичных антител.
Компоненты реакции:
а. исследуемая сыворотка

в разведении 1:25;
б. антиген - взвесь убитых бруцелл (диагностикум Райта).

формах бруцеллеза.
Учет результатов проводится через 18-20 часов.
Учет реакции проводят

по стандарту мутности в зависимости от степени осаждения агглютината и просветления жидкости.
Диагностическим титром принято считать РА не менее 2+ при разведении сыворотки 1: 100 и выше.

стеклянных пластин.
Компоненты реакции:
А - неразведенная сыворотка крови больного
В – антиген

– взвесь убитых и окрашенных кристалл-виолетом бруцелл

Аг в реакциях Райта и Хеддльсона –единый бруцеллезный диагностикум
Реакцию ставят

на обычном стекле, расчерченном на квадраты величиной 4х4 см каждый, 5 квадратов по горизонтали.
На 1-м квадрате с левой стороны записываю № испытуемой сыворотки, в последующие квадраты слева направо разливают испытуемую сыворотку в дозах данных в таблице.
К последней дозе сыворотки добавляют 0, 03 мл изотонического раствора хлорида натрия. Сыворотку осторожно смешивают с Аг палочкой, начиная с минимальной дозы (!). Контроль Аг –ставят р-р хлорида натрия с Аг. Затем слегка подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерной нагревание всей поверхности стекла.

сыворотки с Аг появляются хлопья агглютината.
Максимальный срок наблюдения- 8 минут.
Учет

реакции проводят невооруженным глазом:
За (+) результат принимают агглютинацию не менее 2+ (незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями – 50% агглютинации) во всех дозах сыворотки.

диагностике бруцеллеза у людей и животных, особенно при хроническом течении

инфекции, когда РА может быть отрицательной или положительной в низких титрах.
РНГА является специфичным и высокочувствительным методом выявле­ния бруцеллезных антител в сыворотке крови человека. Для постановки РИГА используют бруцеллезный эритроцитарный антигенный диагностикум.
ИФА применяют для диагностики всех форм заболевания, а также при эпидемиологическом обследовании населения и при отборе лиц для вакци­нации против бруцеллезной инфекции.

бруцеллина – протеиновый экстракт культур бруцелл
Положительная аллергическая реакция (проба Бюрне)

при бруцеллезе бывает при болезни, перенесенном в прошлом; вакцинации; скрытой инфекции.

- морские свинки, белые мыши.
Животных заражают внутрибрюшинно. Вскрывают: свинок на

30-35 сут; мышей на 20-25 сут после заражения.
Бактериологическим методом исследуют л/узлы, печень, селезенку.
Перед посевом кусочки ткани тщательно растирают в ступке поскольку бруцеллы находятся внутриклеточно

из 1-2-суточной агаровой культуры возбудителя (1 х 109 мк/мл), фиксиру­ют

их в этиловом спирте в течение 30 мин, высушивают на воздухе и поме­щают во влажную камеру.
В качестве контролей служат препараты бруцелл, обработанные бруцеллезной сывороткой (положительный контроль) и сы­ороткой, не содержащей антитела к бруцеллам (отрицательный контроль).
Реакцию учитывают путем просмотра препарата в люминесцентном микроскопе. Диагностическим считается титр не менее 1 :4.

сенсибилизированного бруцеллезным антигеном, отвечать спе­цифической местной реакцией на внутрикожное введение

бруцеллина (фильтрат 3-недельной культуры бруцелл) в дозе О,] мл В ладонную поверх­ность предплечья.
Реакция учитывается через 24-48 ч по размеру отека в сантиметрах.
При наличии на месте введения отека не более 2 см в диамет­ре проба считается слабоположительной, 2-6 см - положительной, свыше 6 см - резко положительной.
Гиперемию кожи при отсутствии отека принимают за отрицательный результат.
Введение специфического антигена в сенсибилизированный организм небезразлично для обследуемого. В связи с этим заслуживают внимания эффективные методы выявления ГЗТ методом in vitro.

бруцеллезом организма фагоцитировать бруцеллы in vitro.
В пробирку, содержащую 0,2

мл 2 % раствора цитрата натрия, добавля­ют 0,4 мл исследуемой сыворотки и 0,2 мл специального антигена дЛЯ ОФР (4 х 109 клеток убитых нагреванием бруцелл в 1 мл изотонического раство­ра натрия хлорида). Содержимое пробирок перемешивают и 30 мин инку­бируют в термостате при 37 ОС.
Затем из содержимого пробирок готовят мазки, как для подсчета лейкоцитов, фиксируют их и окрашивают по Козловскому или синькой Мансона.
Учет результатов про изводят путем подсчета количества фагоцитирован­ных одним нейтрофилом бруцелл в учтенных подряд 25 нейтрофильных полинуклеарах.
У здоровых людей фагоцитарный индекс в отношении бруцелл равен 0-5. Фагоцитарный индекс 10-24 характеризует слабовыраженную реакцию.

влиянием специфического антигена, обладает строгой специфичностью, позволяет получить ответ в

короткие сроки - через 3-4 ч после взятия крови.
Реакцию проводят в пробирках из химически чистого стекла. В качестве антигена используют взвесь убитых нагреванием бруцелл (вакцинный штамм В. abortus 19ВА) в концентрации 1 х 107 мк/мл. Кровь для исследования берут в количестве 1 мл и вносят в колбочку с гепарином из расчета 75-80 МЕ гепарина на 1 мл крови. В две пробирки пе­реносят по 0,4 мл гепаринизированной крови. В первую пробирку добавля­ют 0,1 мл бруцеллезного антигена (опытная пробирка), во вторую - 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида (контрольная пробирка). Пробирки встряхивают в течение 2-3 мин и проводят подсчет лейкоцитов в камере Горяева. Затем пробирки инкубируют в термостате в течение 2 ч при 37 ос, периодически встряхивая. После инкубации пробирки вновь встряхивают в течение 2-3 мин и проводят подсчет лейкоцитов. Подсчет производят 2- 3-кратно для каждой пробирки, затем выводится средний показатель. Вычисляют процент лейкоцитов после инкубации к исходному количеству для опытной и контрольной пробирок.
Показатель специфического лизиса лейкоцитов подсчитывают путем определения разницы между про центом уменьшения лейкоцитов в опытной пробирке и процентом уменьшения лейкоцитов в контроле.
Он выражается отрицательной величиной и колеблется в пределах от -10 до -30 %. Пока­затель меньше -10 % свидетельствует о неспецифическом лизисе.

различных объектах ПЦР.
При диагностике бруцеллеза у людей ДНК определяют

в сыворотке крови, спинномозговой и синовиальной жидкости и др.
При оценке результатов ПЦР следует учитывать, что специфический праймер считается родовым и выявляет ДНК всех видов бруцелл, включая и вакцинные штаммы. Это особенно важно для эндемичных по бруцеллезу регионов, в которых для вакцинации животных используют живые бруцеллезные вакцины, которыми может быть инфицирован и обслуживающий персонал.

по своему диагностическому значению не равноценны и не могут заменять

друг друга.
Наиболее надежным способом диагностики бруцеллеза является применение комплексного сероаллергического метода.
В ранние сроки от начала заболевания диагностическая ценность серологического метода выше аллергического; серологические реакции в этот период положительны почти в 98 % случаев. По мере удлинения срока заболевания процент положительных серологических реакций (РА, РНГА) начинает падать.
В поздние периоды заболевания большую диагностическую ценность имеют реакция Кумбса, ИФА и внутрикожная аллергическая проба.

ID)
Cultured from bIood, slow growth оn bIood agar, serology
(

VIRULENCE FACTORS )
Intracellular growth, LPS

)
Pasteurization of dairy products
( TREATMENT )
TMP/SMX; doxycycline

with gentamicin