Слайд 1Методы исследования аминокислот и белков
Выполнила: Наумова М. Ахмадеева Л.
Слайд 2
Методы выделения и очистки белков
1. дробление биологического материала и
разрушение клеточных мембран;
2. фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;
3.
экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);
4. разделение смеси белков на индивидуальные белки
Слайд 3
Методы разрушения тканей и экстракции белков
Гомогенизация биологического
материала
Метод замораживания и оттаивания ткани
Вскрытие ультразвуком
Экстракция белков, связанных
с мембранами, и разрушение олигомерных белков на протомеры
Слайд 4Гомогенизация биологического материала
Ткань, находящуюся в буферном растворе с определённым
значением рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор)
с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о притёртые стенки сосуда.
Слайд 5Метод замораживания и оттаивания ткани
В результате попеременного замораживания
и оттаивания образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.
Слайд 6Вскрытие ультразвуком
Возможно вскрытие клеток ультразвуком, но в этом случае возникает
реальная опасность дробления крупных молекул ДНК и белков.
Слайд 7Экстракция белков, связанных с мембранами, и разрушение олигомерных белков на
протомеры
В раствор добавляют детергенты; чаще всего используют тритон Х-100 или
додецилсульфат натрия. При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протомерами в олигомерных белках.
Слайд 8ДИАЛИЗ
Принцип метода: низкомолекулярные вещества
удаляются из раствора белка и замещаются
буфером.
Слайд 9Методы очистки белков.
Гель-фильтрация
Сефадексы (separation,
pharmacia, dextran) – это поперечносшитые декстраны сзаданными размерами пор.
Биогели
Сефароза-поперечносшитая агароза
Слайд 12Гель-электрофорез
Метод основан на том, что при определённом значении рН и
ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью,
пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).
Слайд 13Аффинная хроматография
(хроматография по сродству)
Аффинная хроматография
отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи
раз.
Слайд 14Ультрацентрифугирование
Метод разделения основан на различии в молекулярных массах белков.
Слайд 16Рентгеновский эксперимент. И как же он ставится?
Исследуемый объект помещают в
пучок рентгеновских лучей и измеряют интенсивность рассеянного в различных направлениях
излучения.
На входе мы имеем неизвестный объект, на выходе дифракционную картину.
Метод основан на дифракции рентгеновских лучей на кристаллической решетке и поэтому применим только к веществам в кристаллическом состоянии.
Слайд 17Кристаллизация
кристалл – это такой образец исследуемого вещества, в котором много
(~1012) идентичных молекул находятся в одинаковой ориентации и их центры
образуют правильную трехмерную решетку.
Наличие пересыщенного раствора – необходимое условие кристаллизации
Слайд 18Кристаллизация
Способа получения перенасыщенного раствора:
1) Заключается в постепенном удалении растворителя обычным
испарением.
2) связан с использованием зависимости растворимости от температуры.
3) связан с
введением в раствор какого-либо вещества, вызывающего понижение растворимости(соли,орг.соединения)
Слайд 19Кристаллизация
Различные модификации кристаллов белка куриного яйца лизоцима: 1 – тетрагональная
модификация, 2 – моноклинная, 3 - триклинная, 4 – игольчатые
кристаллы, 5 – кристаллы неизвестных модификаций. Кристаллы получены в одном растворе при смешении солей-осадителей. Изображение получено с помощью микроскопа фазового контраста.
Слайд 20Кристаллизация
Синхротронный ускоритель.
Станция рентгено-флуорисцентного элементного
анализа «Байкал» Сибирского центра синхротронного излучения
Гигавольтный синхротронный ускоритель. Звеньевые хомуты
KF с быстро прижимными Al уплотнениями
Слайд 21 Литература
Е. Горячева. Рентгеноструктурный
анализ белков
Методы исследования белков и нуклеиновых кислот (Остерман Л.А.)
Биохимия: Учеб.
для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с.
http://www.chem.msu.su/rus/teaching/kolman/84.htm
http://cs6300.userapi.com/u12816816/docs/d105f4de5c84..
http://www.phys.msu.ru/rus/about/sovphys/ISSUES-2008/4(64)-2008/64-4/
http://lenta.ru/news/2009/07/30/prots/
