Методы выделения и очистки целевых продуктов. Методы разрушения клеток

КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Завершающей стадией любого микробиологического производства является выделение целевого продукта

из культуральной среды и его очистка. Таким целевым продуктом может быть либо биомасса клеток, либо какой-то продукт клеточного метаболизма. Если целевой продукт находится внутри клетки (накапливается или входит в состав клеточных структур или оболочки), то он является эндометаболитом, если выделяется клеткой в культуральную жидкость - экзометаболитом.
В большинстве случаев извлечения эндометаболитов необходимо предварительное разрушение клеток. Однако этот процесс удобнее проводить не непосредственно в культуральной среде, извлекаемой из реактора, а с концентратом клеток после удаления культуральной жидкости. Поэтому первым этапом выделения большинства продуктов микробиологического синтеза является отделение биомассы микроорганизмов продуцентов из культуральной жидкости. При этом в зависимости от типа используемых микроорганизмов могут применяться самые различные методы.

Фильтрование бактериальных суспензий сопряжено с большими трудностями, которые обусловлены малым

размером клеток, высокой вязкостью суспензий и наличием большого количества примесей микрочастиц. Поэтому стадии фильтрования обычно предшествует предварительная обработка суспензий с целью максимально возможной коагуляции клеток и примесей в более крупные и легко фильтруемые частицы. Применяются несколько видов коагуляции : тепловая, органическими и неорганическими кислотами, неорганическими солевыми электролитами (Na2SiO3, Na2HPO4), которые взаимодействуют с ионами Са2+, находящимися в культуральной жидкости, с образованием труднорастворимых соединений.
Ca2+ + Na2SiO3 CaSiO3 + 2Na+
 
Ca2+ + Na2HPO4 CaHPO4 + 2Na+
Образующиеся частицы осадка захватывают клетки микроорганизмов и примеси.
Процесс коагуляции улучшается при использовании комбинированных методов, таких, как кислотная и тепловая, электролитная и тепловая коагуляция. Эффективным методом коагуляции суспензий является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами - флокулянтами. При этом в отличие от обычной коагуляции образуются флоккулы, или осадки рыхлой структуры, что значительно улучшает процесс фильтрации.

и тепловая, электролитная и тепловая коагуляция. Эффективным методом коагуляции суспензий

является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами - флокулянтами. При этом в отличие от обычной коагуляции образуются флоккулы, или осадки рыхлой структуры, что значительно улучшает процесс фильтрации
Образующиеся в результате коагуляции и флокуляции крупные частицы перед фильтрованием могут быть подвергнуты седиментации (осаждению под действием силы тяжести) с последующей декантацией надосадочной жидкости, которая далее может быть дополнительно очищена фильтрованием.

и микрогрибов широко используют флотацию. Основной движущей силой флотации являются

всплывающие пузырьки газа, которые захватывают клетки и выносят их на поверхность. В результате над слоем отработанной культуральной жидкости образуется пенный слой, в котором сконцентрированы клетки. Процесс проводят в специальных аппаратах - флотаторах, в которых нагнетают воздух и, в зависимости от их конструкции, диспергируют его через барботер или эжектор, пену гасят и выводят сконцентрированную в 4-6 раз суспензию клеток (получение пекарских дрожжей).

сепарирование (одноступенчатое или многоступенчатое) для разделения суспензий и эмульсий, а

так же центрифугирование для отделения твердых осадков и клеток от культуральной жидкости. Так для сгущения суспензии дрожжей от 20-30 г/л до 550-600 г/л с помощью сепаратора- сгустителя непрерывного действия тарельчатого типа СОС-501 К-3, необходимо последовательное сепарирование в 2-3 ступени. С помощью центрифуг различных конструкций удается отделять из культуральных жидкостей бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Наличие в культуральной жидкости высоковязких компонентов, таких как различные экзополисахариды типа декстрана, аубазидана, пуллулана и др. существенно затрудняет процесс центрифугирования.

микробной биомассы ее либо обрабатывают каким-либо экстрагентом без разрушения клеток

(экстракция петролейным эфиром биожира из кормовой биомассы дрожжей, извлечение полиеновых антибиотиков), либо клетки разрушают каким-либо из методов, а затем экстрагируют продукты.
Для разрушения (дезинтеграции) клеток применяют целый набор методов, которые можно отнести к трем основным группам: физико-механические, химические и энзиматические (ферментные) методы. Все процедуры должны быть достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и в то же время достаточно мягкими, чтобы исключить денатурацию или разрушение целевого продукта. А поскольку клеточные стенки у разных микроорганизмов состоят из различных полимеров (иногда сопоставимых или превосходящих по прочности лучшие сорта сталей), то никакого универсального метода их разрушения не существует.

клеток баллисти­ческим способом с применением бус баллотини, кварцевого песка, растирание

клеток в дисковой мельнице, дробление замороженных в жидком азоте или в сухом льде клеток; экструдирование клеток под высоким давлением через узкую щель или отверстие; газодекомпрессион­ная дезинтеграция, основанная на создании в камере с разрушаемым материалом высокого давления и быстрым сбросом его, приводящим к разрыву клеточных стенок; ультразвуковая дезинтеграция.
Энзиматические методы основаны на применении литических ферментов, разрушающих клеточную стенку: лизоцима, выделяемого из белка куриных яиц и разрушающего главным образом оболочки бакте­ри­альных клеток; ферментного комплекса или продуцируемого некоторыми видами актиномицетов, лизирующего оболочки эукариотических клеток, в частности грибов.
Химические методы дезинтеграции основаны на разрушении клеточной оболочки под воздействием щелочей, кислот, детергентов, ингибиторов синтеза оболочки клетки.

наиболее приемлемы баллистические и экструзионные способы; энзиматические методы широко применяют

в научных исследованиях для выделения в целости различных субклеточных структур (органелл, мембран и т.д.), а так же для получения протопластов. Применение химических методов дезинтеграции микроорганизмов ведет к нарушению целостности клеточных структур, инактивации ферментов. Поэтому химические методы обычно применяют для получения пищевого белка и биожира из дрожжей.