Получение белка в биотехнологическом производстве

факторами:
а) возможностью использования для культивирования микроорганизмов разнообразных химических соединений, в

том числе отходов производств;
б) относительно несложной технологией производства микроорганизмов, которое может осуществляться круглогодично; возможностью его автоматизации;
в) высоким содержанием белка (до 60-70%) и витаминов, а также углеводов, липидов в микробиальных препаратах;
г) повышенным содержанием незаменимых аминокислот по сравнению с растительными белками;
д) возможностью направленного генетического влияния на химический состав микроорганизмов в целях совершенствования белковой и витаминной ценности продукта.

ним относится производство пекарских, винных и кормовых дрожжей, вакцин, белково-витаминных

концентратов (БВК), средств защиты растений, заквасок для получения кисломолочных продуктов и силосования кормов, почвоудобрительных препаратов и др.;
2. Производящее продукты микробного биосинтеза, к числу которых относятся антибиотики, гормоны, ферменты, аминокислоты, витамины;
3. Основанное на получении продуктов брожения, гниения, (например, утилизация целлюлозы и различных отходов с целью получения углеводов, биогаза, биоэтанола). К ним же относятся получение спиртов, органических кислот, растворителей, а также биотехнология утилизации неприродных соединений.

Производство белка микроорганизмами можно разделить на три типа:

метан, водород, метанол, этанол, уксусную кислоту, углекислый газ, молочную сыворотку,

мелассу, крахмал и целлюлозосодержащие отходы промышленности и сельского хозяйства.
Для промышленного использования перспективными являются термофильные микроорганизмы, растущие при высоких (до +50 °С) температурах.
Благодаря некоторым бактериям микробиологическим способом производится ряд незаменимых аминокислот (глютаминовая кислота, лизин и др.), основная часть которых идет в пищевую промышленность и в животноводство.
На основе аминокислот готовят искусственные подсластители. Например, подсластитель метиловый эфир L-аспартил- L-фенилаланин в 150 раз слаще, чем глюкоза.

обнаружили, что клетки животных, инфицированных вирусами, выделяют в сферу фактор,

который способен вызывать у гентактных (не обработанных вирусом) клеток устойчивость у вирусной инфекции.
Этот фактор был назван интерфероном.
Интерферон относится к протеинам или гликопротеинам, в состав которых включено 146-166 аминокислотных остатков. Молекулярная масса – 20-80 кДальтон.

Биотехнология производства интерферона

вирус, а стимулирует образование интерлейкина-2, увеличивает синтез ферментов (эндонуклеазы -

способны «разрезать» молекулы нуклеиновых кислот вирусов на уровне трансляции; и протеиназы).
2.  Вызывает ингибирование клеточного роста (используется как противоопухолевое средство) – способен подавлять деление онкогенных клеток при сохранении функции активации всех звеньев иммунной системы.
3.  Оказывает стимулирующее влияние на фагоцитоз, естественные клетки – киллеры и макрофаги; повышает неспецифическую резастентность клеток.

Эффекты интерферона

радиозащитное действие.
6.  Интерферон является иммуномодулятором – т. е. регулирует иммунологические

реакции, стимулирует иммунную систему организма.


Вырабатывается интерферон клетками позвоночных.
Наиболее активными продуцентами интерферона являются лимфоциты и макрофаги.
Наиболее активными индукторами среди вирусов являются вирус Ньюкаслской болезни, вирус Сендай, чумы свиней.

выделенных из крови доноров.
Различают 20 рекомбинантных вариантов, отличающихся последовательностью

аминокислот в полепептидной цепи и биологической активностью.
2.  Фибробластный или β-IFN - для получения используют культуру фибрабластов.
3.  Иммунный или γ-IFN - его синтезируют сенсебилизированные Т-лимфоциты при повторном контакте с мутогенами, а также с бактериальными и вирусными антигенами.
Все три класса интерферонов обладают различными физико-химическими свойствами и отличаются друг от друга серологически.

Классы интерферона

интерферона в организм, использование мазей, содержащих интерферон.

2.  Эндогенная – введение

в организм индукторов интерферон, которые стимулируют процесс образования интерферона.

Наиболее активными индукторами интерферона являются синтетические и природные двунитевые РНК.

Виды интерферонизации

антител.
2.  Тормозят рост и метастазирование опухолей.
3.  Проявляют антиклеточную активность.
4.  Оказывают

радиозащитное действие.
5.  Увеличивают чувствительность клеток к действию интерферона.
6.  Принимают участие в регуляции биосинтеза белка в клетке.

Механизм действия индукторов IFN

выделяют после индукции синтеза интерферона);
2. Получение кДНК на матрице иРНК;
3.

Встраивание кДНК в векторную плазмиду с участием ферментов рестриктаз и лигаз и получение рекомбинантной ДНК (рДНК), содержащей ДНК вектора с генетическими маркерами и ДНК, кодирующую синтез целевого продукта;
4. Трансформация рДНК в рецепиентную (пермиссивную) микробную клетку;

Биотехнология производства IFN (этапы)

синтезировать интерферон (на плотной питательной среде);
6.Размножение клоновой культуры – продуцента

в жидкой питательной среде;
7.Отделение клеток из культуральной жидкости центрифугированием;
8.Выделение целевых белков из нативного раствора или лизата биомассы продуцента, например, осаждением сульфатом аммония;

помощью аффинной хроматографии при использовании сорбента, связанного с моноклональными антителами

к интерферону.
При пропускании раствора, содержащего целевой продукт и балластные вещества через колонку с иммуносорбентом происходит высокоспецифическое связывание антигена (интерферона) с моноклональными антителами к нему, все прочие вещества не задерживаются. Затем интерферон элюируют слабой кислотой, происходит диссоциация комплекса «антиген-антитело».
Для получения 60 мкг лейкоцитарного интерферона нужно 100 л крови или 1 л культуральной жидкости микроорганизма-рекомбинанта

coli (α, β, α-IFN).
2.  Возможен синтез химическим путем β и

α- интерферона.
3.  Повышение биосинтеза IFN возможно при введении в эукариотическую дрожжевую клетку вектора, на основе которого сконструирована рекомбинантная молекула ДНК с ионами β и α- интерферонов
4.  Производство IFN с применением моноклональных антител к соответствующему IFN.

Другие способы получения интерферона:

основные группы:
этиотропные, действующие на возбудителя заболевания;
иммуномодулирующие, корригирующие нарушение системы иммунитета,

возникающие и развивающиеся в процессе болезни;
патогенетические, направленные на борьбу с интоксикацией, обезвоживанием, сосудистыми поражениями, органными нарушениями, аллергическими реакциями, а также на профилактику бактериальных осложнений;
симптоматические, купирующие сопутствующие симптомы заболевания (головная боль, бессонница, кашель и др.).

образом средства этиотропной терапии.
ИНФ и их индукторы обладают комбинированным

эффектом (этиотропным и иммуномодулирующим),
Иммуномодуляторы используются для иммунотерапии и иммунокоррекции.

важно при терапии вирусных пневмоэнтеритов молодняка.
2.  Действие интерферона обуславливается активацией

естественных механизмов защиты организма на ранних стадиях инфекционного процесса.
3.  Эффект проявляется сразу же после введения препарата.

12ч.).
Препарат применяется в основном только парэнтерально.
Через 2-3 дня

после применения интерферона наблюдается угнетение защитных функций иммунной системы, что может привести к быстрому размножению в организме условно-патогенной микрофлоры.
Возможны аллергические реакции при длительном применении.

иммунокомпетентными клетками.
В настоящее время выделено и охарактеризовано 15  интерлейкинов.

К интерлейкинам, играющим существенную роль в кооперативных взаимодействиях иммуно-компетентных клеток при развитии иммунного ответа, являются ИЛ 1, ИЛ 2, ИЛ 4, ИЛ 5, ИЛ 6.

В-лимфоцитов. С участием ИЛ 1 активируются Т-хелперы, синтезирующие ИЛ 2,

а также β-лимфоциты, трансформирующиеся в плазматические клетки антителопродуценты. Он является посредником в обеспечении взаимодействия различных защитных противоинфекционных механизмов на уровне организма.
ИЛ 3 - цитокин, синтезируемый Т-лимфоцитами, стимулирует β-лимфоциты при гуморальном иммунном ответе и созревание Т-эффекторов в реакциях клеточного иммунного ответа. ИЛ 3 является ключевым фактором развития иммунного ответа.

аллергические реакции организма. С помощью ИЛ 4 Т-хелперы влияют на

продукцию lgE в процессе развития иммунного ответа. Основными продуцентами ИЛ 4 являются нормальные Т-лимфоциты и Т-клеточные гибридомы.
ИЛ 5 – мультифункциональный цитокин, активирующий Т- и В-лимфоциты и эозинофилы; является продуктом активированных Т-лимфоцитов.
ИЛ 6 – один из ранних цитокинов, продуцируемый многими типами клеток (В стимулирующий фактор, фактор роста гибридом/плазмоцитом, Т-лимфоцитактивирующий фактор), участвует в регуляции функций лимфоцитов, обладает противовирусным действием.

трансформированных (опухолевых) клеток;

Т-клеточные гибридомы (продукты гибридизации опухолевых лимфоцитов, способных

к нормальному росту и Т-клеток, синтезирующих определенный ИЛ;

рекомбинантные микробные клетки, полученные методами генной инженерии).

Биотехнологическое получение интерлейкинов

выделяют из культуральной среды, концентрируют, очищают.
Для увеличения продукции ИЛ культуры

клеток стимулируют митогенами (веществами, вызывающими митотическое деление клеток). В качестве митогенов используют глобулярные растительные белки (фитогемаглютинин и др.), а также компонент клеточной стенки бактерий – мурамилдипептид.

Биотехнологическое получение интерлейкинов

синтез, вводят в составе вектора в микробную клетку,
-выделяют и

размножают клон рекомбинантов,
- культивируют полученный продуцент с целью накопления ИЛ.
В качестве рекомбинантных организмов используют клетки E.coli (ИЛ 1, ИЛ 2), дрожжи-сахаромицеты (ИЛ 2), причем дрожжи более удобны, т.к. клетки E.coli накапливают ИЛ внутриклеточно, а дрожжи выделяют в окружающую среду, следовательно, полученный продукт легче отделяется от клеток и очищается.

Биотехнологическое получение интерлейкинов

биосинтетических процессов,
усиливает биосинтез белков, ДНК, РНК и гликогена,
способствует

мобилизации жиров из жировых депо и ускоряет распад высших жирных кислот и глюкозы,
повышает содержание в крови особых стимулирующих рост факторов – соматомединов.

Гормон роста

в двухнитиевую форму получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, который расщепляется

в бактериальных клетках с образованием активного гормона.
На первом этапе клонировали двухнитиевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, за исключением первых 23 аминокислот.

Биотехнологическое получение гормона роста

до 23-й.
На третьем этапе два полученных фрагмента объединили вместе,

и «подстроили» к паре промоторов и участку связывания рибосом.

Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры или 1 % от растворенных белковых клеток этого генетически сконструированного штамма E.coli.

Биотехнологическое получение гормона роста

- является ключевым звеном патогенеза сахарного диабета 1-го типа.
Нарушение

действия инсулина на ткани - относительная инсулиновая недостаточность - имеет важное место в развитии сахарного диабета 2-го типа.
Число больных диабетом во всем мире составляет 130 млн. (2,5% населения). Каждые 10-15 лет количество больных  удваивается. По оценке Международного института диабета (Австралия), к 2020 году в мире будет 320 млн. больных. В действительности число  больных в 2-3 раза больше за счет скрытых  недиагностированных форм.

Инсулин

из поджелудочных желез человека (оба способа не подходят из-за неэкономичности:

недостаточной разработанности первого способа и недостатка сырья для массового производства вторым способом);
3) полусинтетическим методом с помощью ферментно-химической замены в положении 30 В-цепи аминокислоты аланина в свином инсулине на треонин;
4) биосинтетическим способом по генноинженерной технологии.
Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки

Соболев доказал, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным  гормоном поджелудочной железы.

в 1922

году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему  мальчику, больному диабетом 1 типа.

1923 г. американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.

в 1935 году датский исследователь  Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат.

в 1952 году были получены первые кристаллы инсулина.

инсулина.
К концу 60-х годов развитие методов очистки гормона от

других гормональных веществ и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным.
В начале 70-х г.г. А.Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина, однако осуществление данного синтеза в промышленном масштабе было дорогостоящим и нерентабельным.
В 80- годах достижения молекулярной биологии позволили синтезировать  с помощью E.coli обе цепи человеческого инсулина, которые были затем соединены в молекулу биологически активного гормона
в начале 90-х г. в Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli.

стадий:
1. Измельчение замороженных поджелудочных желез и экстракция кислым спиртовым раствором.
2.

Осаждение балластных белков и освобождение от липидов.
3. Изоэлектрическое осаждение фракций инсулина (при pH=5,5) и осаждение спиртом, ацетоном, эфиром.
4. Очистка инсулина: осаждение солями, фракционирование методами хроматографии, гель-фильтрации.
5. Осаждение инсулина в виде кристаллов.
6. Переосаждение цинк-инсулина.

бисмацерации 1,5-4 часа при постоянном перемешивании (первый раз 80-85 %

этанолом в реакторе с мешалкой, второй раз экстрагируют 57% этанолом, который подкислен ортофосфорной кислотой (хлороводородной или серной) до значения pH 2,8-3).
Подкисленный спирт способствует инактивации фермента трипсина, находящегося в поджелудочной железе, благодаря чему удается сохранить инсулин в неизменном состоянии.
На Минском заводе эндокринных препаратов используют роторно-пульсационный аппарат для экстракции, что дает интенсивность экстрагирования и сокращает время до 1,5ч.

для освобождения от нежелательных белков, которые выпадают в осадок.
4.

Осадок отделяют центрифугированием и удаляют.
5. Для выделения и очистки инсулина применяют ионообменную хроматографию. Осуществляют сорбцию инсулина из прозрачной жидкости на макропористом сульфокатионите КУ-33-30/100 при значении pH 3,0-3,3 в режиме псевдоожижения.
6. Жир удаляют путем промывки катионита 65-67% этанолом, а балластные белки 0,3М раствором ацетатного буфера.

(pH 10) и немедленно подкисляют хлороводородной кислотой до pH 4,5

и добавляют ацетон.
8. Выпавший осадок балластных веществ удаляют.
9. Инсулин осаждают раств. цинка-ацитата (pH 6,2).
10. Полученный цинк-инсулин очищают методом кристаллизации, после чего растворяют в воде, подкисленной до pH 2,8 лимонной кислотой. Раствор отстаивают 1ч.
11. Выпавшие балластные вещества удаляют фильтрацией через кизельгур.
12. Фильтрат смешивают с ацетоном, добавляют хлористый цинк и охлажденный до 0ºС фенол.

pH раствора:
раствор подщелачивают до pH 8,5; оставляют на 2-3 мин;
изменяют

pH до 6,8 и перемешивают 1 ч;
при значении pH 6,5 перемешивают 2 ч;
при pH 6,2 и 6,0 перемешивают 2 ч и отстаивают 20ч;
при значении pH 5,8 перемешивают 2ч;
отстаивают 96 ч при температуре 5 °С.
14. Выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают на воронке Бюхнера последовательно холодной водой, ацетоном, эфиром.
15. Досушивание проводят на воздухе, в вытяжном шкафу и эксикаторе.

фирмой Genbiotech GmbH (Гейдельберг) в 1987—1989 гг.

Процесс был основан

на продуцировании генноинженерным штаммом Е. coli рекомбинантного белка (молекулярная масса около 17000 Да), содержащего лидерную аминокислотную последовательность, соединенную через аминокислотный остаток метионина с проинсулином человека.

в ферментере).
2. Отделение биомассы.
3. Разрушение клеток с выделением телец включения.
4.

Очистка рекомбинантного белка (2 садии)
- ионообменной хроматографией на DEAE-сефарозе FF
- гель-фильтрацией на сефадексе G-25M.
5. Расщепление рекомбинантного белка бромцианом.
6. Окислительный сульфитолиз проинсулина.

F,
ионообменной хроматографией на DEAE-сефарозе FF
гель-фильтрацией на сефадексе G-25M).
8.

Ренатурация проинсулина.
9. Хроматографическая очистка нативного проинсулина ионообменной хроматографией на DEAE-сефарозе FF.
10. Ферментативное расщепление проинсулина.
11. Хроматографическая очистка инсулина:
- ионообменная хроматография на S-сефарозе FF,
- ультрафильтрация,
- гель-фильтрация на сефадексе G-50 SG.
12. Лиофильная сушка Na-соли инсулина человека.

Получение посевного материала штамма-продуцента
1.1. Оживление консервированной культуры.
1.2. Выращивание маточной культуры.
1.3.

Выращивание инокулята.

2. Биосинтез гибридного белка
2.1. Выращивание продуцента в ферментере (ферментация).
2.2. Получение биомассы (сепарирование).
2.3. Дезинтеграция клеточной суспензии.
2.4. Выделение и отмывка телец включения (центрифугирование).

Выделение и очистка рекомбинантного белка
3.1. Солюбилизация телец включения и восстановление

рекомбинантного белка.
3.2. Ренатурация рекомбинантного белка.
3.3. Хроматографическая очистка рекомбинантного белка.
4. Ферментативное расщепление рекомбинантного белка
5. Хроматографическая очистка инсулина 1
6. Хроматографическая очистка инсулина 2
7. Хроматографическая очистка инсулина 3
8. Получение кристаллического инсулина

109 с рекомбинантной плазмидой pPINS 07.
Рекомбинантная плазмидная ДНК содержит искусственный

ген, кодирующий гибридный полипептид, состоящийиз:
одного IgG-связывающего домена белка А из Staphylococcus aureus,
пептидного линкера His6GlySerArg,
и проинсулина человека.
Плазмида (5051 п. о.) содержит в качестве маркера ген β- лактамазы (устойчивости к ампициллину).
Экспрессия рекомбинантного белка индуцируется изопропил- β-D-тиогалактозидом и достигает 30% от суммарного клеточного белка.

высоком давлении для сбора телец включения, многократно отмывают полученные тельца

включения от водорастворимых белков и иных клеточных компонентов.
За 1 цикл получают 15—25 кг влажных телец включения, содержащих более 13% рекомбинантного белка.
2. Полученные тельца включения солюбилизируют в буферном растворе, содержащем мочевину и дитиотреитол (ДТТ) для восстановления внутри- и межмолекулярных ди-сульфидных связей в рекомбинантном белке.
3. Восстановленный рекомбинантный белок подвергают воздействию кислорода воздуха при сильном разбавлении, при этом белок окисляется с образованием дисульфидных связей, соответствующих нативной конформации инсулина (рефолдинг). Происходит ренатурация рекомбинантного белка.

расщеплению трипсином и карбокси-пептидазой Б в массовом соотношении 4000 :

2 : 1.
6. После осаждения и предварительной обработки получают инсулин-сырец 86—88%-ной чистоты.
7. Очистка.
- На первой стадии очистки гидрофобной хроматографией содержание инсулина достигает 96%,
на второй стадии очистки ионообменной хроматографией проводится окончательное освобождение от иммуногенных фракций,

препарата до фармакопейного.
7. В завершении процесса получают кристаллический цинк-инсулин,

который высушивают до необходимой степени влажности.
Выход продукта составляет не менее 100 г с 1000 л культуральной жидкости штамма-продуцента.
Преимущества процесса:
одностадийная очистка ренатурированного рекомбинантного белка;
совместное ферментативное расщепление рекомбинантного белка трипсином и карбоксипептидазой Б;
эффективное использование хроматографии низкого давления для очистки инсулина.

Американской Фармакопеи (Ф. США) и Европейской Фармакопеи (ЕФ).
Инсулин должен

быть охарактеризован качественно.
Первый показатель определяется методом ВЭЖХ в сравнении со стандартом, сравнением хроматографических профилей инсулина и инсулина-стандарта, расщепленных специфическим ферментом на 4 фрагмента («метод пептидных карт») и определением биоидентичности (in vivo, на кроликах, по сравнительному содержанию глюкозы в крови).
Количественное определение проводится также методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Количество гормона принято оценивать в международных единицах (ME), при этом 1 ME (IU) = 0,0347 мг инсулина.