СОВРЕМЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ПРИКЛАДНЫЕ ПОДХОДЫ К КОНСТРУИРОВАНИЮ КОРРЕКТОРОВ

Шендеров, профессор , д.м.н.
ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского
E-mail: shenderof@yandex.ru
23 ноября

2012, Санкт-Петербург
ГАСТРОСЕССИЯ-2012

и архибактерий. «Метагеном» этого суперорганизма состоит из генов собственно Homo

sapiens и генов (микробиом) , присутствующих в геномах микроорганизмов, колонизирующих его тело

J. Lederberg. Infectious history. Science 2000; 288: 287-9

миллионов генов в его микробиоме

Транскриптомика-около 1000000 мРНК, ответственные за
синтез

клеточных белков

Протеомика-около 1000000 белков образуемых в клетках

Метаболомика- около 6000 низко молекулярных метаболи-
тов, образуемых в клетках человека. Современные
robot/gene chip техноло-гии позволяют провести анализ
до 100000 метаболических реакций в течение суток
и выявлять эффекты разнообразных факторов
на организм человека

и квадриллион вирусов, что в 10-100 раз превышает общее число

соматических и зародышевых клеток человека. В ДНК человека идентифицировано 23000, в микробиоме - более 10 млн генов
Количество видов, обнаруживаемых у человека колеблется от 10 до 30 тыс, штаммов до 70 тыс. Доминантные виды (160-300 видов) различаются по частоте обнаружения: лишь18 видов обнаруживается у всех лиц, 75 - у 50%, 57 - у 90% лиц; видовой состав относительно стабилен у конкретного человека. Содержание бактерий (КОЕ/г) и количество видов у отдельных индивидуумов может различаться в 12 - 2200 раз.
Более 99% прокариотических организмов облигатные анаэробы; лишь представители 700-1000 видов бактерий могут быть культивированы. Преобладают представители филов Bacteroides и Firmicutes, за которыми следуют Actinobacteria, Proteobacteria, и Archea.
По соотношению Bacteroides, Prevotella Ruminococcus большинство людей делят на три «энтеротипа»

Микробиота человека имеет выраженный индивидуаль-ный характер и различается как на видовом, так ина штаммовом уровне. Внутривидовые различия среди штаммов достигают 25% и более их генома.

ответственных за микробную колонизацию кишечника
Иммунная система
Физико-химическая характеристика анатомической области

кишечника
Факторы окружающей среды, лекарственные препараты, хирургические вмешательства, различные острые и хронические заболевания, другие стрессовые воздействия и т.д.)

определяют структурные изменения в составе кишечной микробиоты; генетическая предрасположенность ответственна

не более , чем на 12% за подобные особенности микробиоты [Zhang C. et al. ISME J. 2010]

ОСОБЕННОСТИ ПИТАНИЯ, СВЯЗАННЫЕ СО СРЕДОЙ И ТЕРРИТОРИЕЙ ПРОЖИВАНИЯ
Питание коренного населения тропиков и субтропиков
Питание жителей пустынь
Питание жителей высокогорья
Питание коренных северян
Строгое вегетарианство
«Вестеризированное» питание

человека, начинают проявляться со 2-го жизни, достигая полного своего разваития

к 10-14 годам.

Функции кишечной микробиоты

С современных позиций метаболические, сигнальные, транспортные и иные функции индигенной микробиоты более важны, чем присутствие в кишечнике или других областях тела человека определенных бактериальных видов.

обмене
Участие в метаболизме белков, жиров и углеводов
Участие в обеспечении эукариотических

клеток пищеварительного тракта энергией
Участие в кишечно-печеночной рециркуляции желчных кислот и других макромолекул
Иммуногенная роль, включая участие в формировании иммунологической толерантности к пищевым и микробным антигенам
Участие в обеспечении колонизационной резистентности
Детоксикация экзогенных и эндогенных токсических субстанций и соединений, в том числе модуляция функций цитохромов Р 450 в печени и продукция Р450-схожих цитохромов
Мутагенная/антимутагенная активность; антиоксидантная активность
Регуляция поведенческих реакций
Хранилище микробного генетического материала
Продукция низко-молекулярных соединений различной химической природы, обладающих широким спектром биологической, фармакологической активности и/или являющихся предшественниками, ко-факторами ферментов, гормонов, а также сигнальными молекулами
Регуляция стабильности метагенома, репликации и фенотипической экспрессии генов прокариотических и эукариотических клеток
Регуляция запрограмированной гибели эукариотических клеток (апоптоза)
Участие в эпигеномных и пост-трансляционных реакциях организма хозяина, а также в обмене информации между прокариотическими и/или эукариотическими клетками хозяина
Участие в этиопатогенезе заболеваний

Количество людей с

Содержание микроэлементов
(мг/сутки) дефицитом микроэлемента (мг/кг) в содержимом
(миллиарды) толстой кишки
Цинк 30.0 4,5 499,6 ±54,4
Медь 2.0 3.6-3.8 46,9 ± 4,4
Хром 0.15 3 1,44 ±0,15
Железо 20.0 1 584,9 ±120,2
Йод 0. 15 1 2,8 ±0,43
Селен 0.1 1 1,73+0,17

реакциях, межклеточном обмене информации, в поддержании стабильности метагенома, в эпигеномной

регуляции экспрессии генов и пост-трасляционной модификации белков

Лактоны, пептидные феромоны, фураноны и другие аутоиндукторы , участвующие в реализации кворум-сенсинг феномена
Белки, АТФ и другие соединения, продуцируемые при стрессовых воздействиях
Летучие жирные и другие органические кислоты
Различные белки, пептиды и аминокислоты
Разнообразные простейшие метаболиты микробных клеток (CH4, H2S, NO, CO, H2O2, и т.д.)
Нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, нуклеозиды
Витамины
Амины, полиамины, гормон-схожие субстанции, нейротрансмиттеры
Полисахариды, олигосахариды, пептидогликаны, липотейхоевые кислоты, гликопептиды, липополисахариды и другие
Антимикробные соединения
Лектины, биосурфактаны, пигменты и т.д.

ПРОКАРИТИТЧЕСКИХ ОРГАНИЗМОВ,
МОДИФИКАЦИЯ СТРУКТУРЫ ДНК (метилирование, биотилирование)
МОДИФИКАЦИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ (гистонов)

ХРОМАТИНА (метилирование, ацетилирование, фосфорилирование, биотилирование, рибозилирование и т.д.)
РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ
ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ГЕННЫХ ПРОДУКТОВ (протеолитическое расщепление, гликозилирование, метилирование, ацетилирование, фосфорилирование, биотилирование и т.д.)

всей индивидуальной жизни.

Возникшие в раннем онтогенезе эпигенетические
изменения могут наследоваться

и стать ключевыми в процессах, связанных со здоровьем, долголетием и
хроническими заболеваниями.

Наиболее выраженное влияние на формирование
эпигенома человека, фенотипическое проявление которого отмечается на протяжении всей его
последующей жизни, оказывают питание, патогенная и индигенная микробиота в первые 1000 дней от начала беременности.

генов
Доноры эффекторных субстанций, взаимодействующих с мишенями в нуклеиновых кислотах

и белках
S-аденозил-метионин — метильная группа
Ацетил-Коэнзим А — ацетильная группа
Никотинамид аденин динуклеотид (НАД+) — рибозильная группа
Аденозин трифосфат (АТФ) — фосфатная группа Биотин — биотин
Двух- и одноцепочечные РНК — микроРНК
Ферменты
ДНК, РНК и гисмтон метилтрансферазы; демитилазы,
Ацетилтрансферазы; деацетилазы
Рибозилтрансферазы; гидролазы
Фосфотрансферазы; киназы
Bir A лигаза
Синтетазы, нуклеазы, ДНК-лигазы и другие

обратимо модифицировать микробную экологию организма человека. Это сопровождается нарушением структуры

и функций метагенома, метаэпигенома, метаболизма, обмена передачи межклеточной информации и, как следствие, предрасполагает к риску многих хронических заболеваний и преждевременному старению

пробиотики
Пробиотики, изготовленные с использованием приемов синтетической биологии
Пребиотики
Синбиотики
Метабиотики
Трансплантация фекального содержимого

Микроэкологическая инженерия

tract


Пробиотики оказывают положительные эффекты на организм:
- в результате как

длительной, так и кратковременной колонизации;
путем оказания как местного , так и системного эффектов;
эти эффекты могут быть как прямые, так и опосредованные, специфические и неспецифические

al., 2008) .

желчь, окислительный и осмотический стрессы)

-Выраженность адаптационного метаболизма (способность к

утилизации углеводных и иных субстратов и т. д.)

-Способность к адгезии и ее выраженность (количество и типы поверхностных муцин- и фибронектин-связывающих белков, экзополисахаридов, липотейхоевой кислоты и т.д.)

микроорганизмов в пищеварительного тракта хозяина
Взаимодействие с индигенной микробиотой
3. Взаимодействие с

эпителием кишечника и модуляцию местного иммунитета
4. Взаимодействие с клетками организма хозяина и модуляцию метаболических и иных процессов , локализованных или протекающих вне желудочно-кишечного тракта

или модификация растительных гликозидов, а также пищевых и эндогенных лектинов

с различными эффектами на организм хозяина
- Влияние на число интактных, поврежденных и мертвых индигенных микроорганизмов в желудочно-кишечом тракте
- Высвобождение различных микробных биоактивных молекул (например ЛПС) из патогенных и оппортунистических микроорганизмов с различными эффектами на макроорганизм
- Стимуляция Paneth- клетками секреции β-дефензинов
- Модификация стероидных соединений с формированием структур, обладающих измененной способностью индуцировать экспрессию генов эукариотических клеток

УКАЗАНИЯ ПО САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ БЕЗОПАСНОСТИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПОТЕНЦИАЛА
ПРОБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ,

ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

новых мишеней приложения известных и новых пробиотиков (антиоксидантная, противовоспали-тельная, антимутагенная

активности, влияние на психический статус, определенные проявления эпигенотипа, модуляция кворум-сенсинг )
Поиски пробиотических штаммов среди доминирующих анаэробных кишечных микрооорганизмов или видов, постоянно присутствующих, но в небольших количествах, в том числе наиболее жизнестойких штаммов
Создание симбиотических пробиотиков на основе штаммов, участвующих одновременно в реализации определенной физиологической функции, биохимической или поведенческой реакции или их обогащение наночастицами низк. мол. соединений («функциональные» пробиотики)
Разработка пробиотиков для большинства человеческой популяции, для специфических контингентов, для персонального использования
Детальное исследование генома и метаболома известных и потенциальных пробиотиков с целью выявления генов, ассоциируемых с определенными биологически активными соединениями
Использование известных пробиотиков в качестве стартерных культур в биотехнологии для промышленного производства субстанций с биологической и/или фармакологической активностью

определить оптимальное количество бактерий для оказания пробиотического эффекта
-отсутствуют точных знания

о механизмах и всех мишенях эффекта пробиотиков
-у большинства известных пробиотиков заявленный позитивный эффект кратковременен, отсутствует или не ясно выражен
-не все пробиотики являются полностью безопасными для человека даже, если они принадлежат к Lactobacillus или Bifidobacterium видам. Ситуация становится еще более сложной, если пробиотические штаммы принадле-жат к Enterococcus, Streptococcus, Escherichia, Bacillus, Bacteroides или другим родам
-пробиотические бактерии могут вызывать оппортунистические инфекции, вызывать аллергические осложнения, аутоиммунные нарушения, способствовать аггрегации тромбоцитов, вызывать микроэкологические нарушения в пищеварительном тракте, модифицировать экспрессию генов в индигенных бактериях и прокариотических клетках, участвовать в горизонтальном переносе генов антибиотикорезистентности, традиционных и новых факторов патогенности (гемолиз, D-галактоза, ДНК-метилтрансферазы, сиртуины, глюкоронидаза, ацетоальдегид, pks –гены и т.д.)

направление генной инженерии. Она объединяет научные и инженерные подходы для

разработки новых биологических систем, многие из которых ранее никогда не обнаруживались в природе
В настоящее время в мире существует более 100 научных групп и лабораторий, работающих в различных областях синтетической биологии, в том числе и в области создания новых типов пробиотиков на основе живых микроорганизмов

рост и/или активность(и) одного или ограниченного количества представителей рода(ов)/ вида

в кишечной микробиоте, которые оказывают позитивные эффекты на организм хозяина (Roberfroid M et al., 2010).
-Улучшают или стабилизирую состав кишечной микробиоты и улучшают функции кишечника
-Увеличивают абсорбцию минералов и улучшают здоровье костей
-Модулируют продукцию пептидов в пищеварительном тракте, энергетический метаболизм и чувство насыщения
Способствуют индукции (после рождения) и регуляции иммунных функций
Улучшают барьерную функцию кишечника, уменьшают метаболическую эндотоксемию
Снижают риск кишечных инфекций, ожирения, сахарного диабета 2-го типа и других метаболических заболеваний
Снижают риск воспалительных процессов и улучшают контроль за ними в кишечнике
Снижают риск рака толстой кишки

т.д.)
Олигосахариды (лактулоза, галактоолигосахариды, фруктоолигосахариды, соевые олигосахариды-стахиоза и т.д.)
Полисахариды (пектин, инулин,

хитозан, пуллулан и т.д.)
Ферменты (микробные галактозидазы, протеазы сахаромицетов и т.д.)
Пептиды (соевые, молочные и т.д.)
Аминокислоты (валин, аргинин, цистеин, глутаминовая к-та и т.д.)
Антиоксиданты (витамины А, С, Е, каротины, глутатион, убихинон, соли селена и т.д.)
Ненасыщенные жирные кислоты (омега-3 и др.)
Органические кислоты (масляная, пропионовая, уксусная, лимонная и др.)
Растительные и микробные экстракты (морковный, картофельный, томатный, рисовый, чесночный, дрожжевой и др.)
Другие (лецитин, парааминобензойная кислота, лизоцим, лактоферрин, глюкановая кислота, крахмальная патока и т.д.)
Пребиотики на основе полисахаридов микробного происхождения

оказывающих синергидные эффекты на кишечную микрофлору на всем протяжении пищеварительного

тракта:
-дисахарид лактитол
-фруктоолигосахариды
-полисахарид гуммиарабик, изолированный из акации
Восстанавливает микробиоту, нормализует метаболизм, морфологию и подвижность кишечника, оказывает профилактический и лечебный эффект при антибиотико-ассоциированной диарее, запорах, целеакии, способствует эрадикации геликобактера , улучшает микробную экологию лиц с теми или иными проявлениями метаболического синдрома

метаболиты и/или сигнальные молекулы способные оптимизировать физиологические функции, регуляторные, метаболические

и/или поведенческие реакции через модификацию активности индигенной микрофлоры или эукариотических клеток хозяина

качестве
-Метаболических молекул (предшественников или ко-факторов биоактивных соединений)
-Сигнальных молекул
-Транспортных молекул
-Молекул, обладающих

одновременно метаболической , транспортной и/или сигнальной активностью
Их эффекты могут проявляться на различных уровнях:
-Молекулярном (структуры ДНК и хроматина; РНК- интерференция; пост-трансляционная модификация генных продуктов)
-Клеточном (на поверхности и мембранах клеток,
в митохондриях и рибосомах)
-Внутри клеточной цитоплазмы
-В межклеточном пространстве
-В тканях, органах, физиологических системах
-На уровне всего организма

на которые потенциально могут воздействовать различные метабиотики
Поддерживать стабильность структуры

ДНК, РНК, хроматина , гистонов и участвовать в их эпигеномной модификации
Восстанавливать точечные нуклеотидные нарушения в хромосомах, митохондриях и плазмидах
Регулировать процессы транскрипции и трансляции, РНК-интерференции
Участвовать в пост-трансляционной модификации генных продуктов (активации или ингибировании процессов протеолитического расщепления, ацетилирования, метилирования, гликозилирования, фосфорилирования и др.)

применение в промышленном производстве метабиотиков

Коротко-цепочечные жирные кислоты, другие органические

кислоты
Различные белки, пептиды, аминокислоты,
Нуклеиновые кислоты, нуклеотиды
Полисахариды, пептидогликаны
Плазмалогены, витамины, антиоксиданты, различные кофакторы (Коэзим А, коэнзим Q и другие)
Различные транспортные и сигнальные молекулы

ингредиентов пищевого и микробного происхождения

а) валентность и изотопное состояние

химических элементов в молекуле ингредиента
б) структурная (α-, β-,γ) или стереоизомерная (L-, D-), формы молекулы ингредиента
в) растворимость, дисперсность, связи с лигандами функциональных макро- и микронутриентов
г) состояние окисления
д) взаимодействие с другими компонентами продукта (конкуренция за транспортные белки, места абсорбции, наличие усилителей или ингибиторов эффекта ингредиента)
е) период полувыведения из организма и факторы, влияющие на этот процесс
Ж) безопасность в рекомендуемой дозе и длительности применения

или ингибировать соответствующие эпигенетические процессы. Это повысит устойчивость человека к

негативным средовым воздействиям, и позволит эффективно бороться с патологиями, возникающими, как результат эпигеномных нарушений.

эпигеномных процессах (Li, Tollefsbol, 2010; Shenderov, 2011; 2012; Шендеров, 2012)
Моно-,

ди-, олиго- и полисахариды,
ДНК, РНК, аденин, цитозин, гуанин, никотинамид, АТФ
Пищевые полифенолы и каротиноиды (эпикатехины, генестеин, кверцитин, гесперетин, лутеолин, гарцинол, изоцианаты, куркумин, резвератрол, кумарин)
Убихинон (Ко-энзим Q-10);
Альфа-липолевая кислота, мелатонин
Ацетальдегид
Селен, магний, калий, цинк, йод, кобальт, железо, кальций, марганец, медь
Пируват, цитрат, лактат, α-кетоглютарат, сукцинат
Спермедин

Фолат, B1, B2, B12, B6; C, E, D-3, биотин, пантотеонат, нико-тиновая, оротовая кислоты, холин
Белки, пептиды, аргинин, лизин, метионин, цистеин, β-аланин, валин, лейцин, серин, треонин, гистидин, триптофан, аспарагиновая кислота, ацетил-L-карнитин, карнозин
Фосфолипиды, EPA, DHA
Глукозамин
Бутират, пропионат, ацетат, каприловая кислота
Сульфорафен цистеины крестоцветных овощей,
Бетаин
Аллил-меркаптаны чеснока

метабиотиков

Ингибиторы синтеза белка на уровни рибосом
Антагонисты рецептор-лиганд взаимоотношений (например,

трансизомеры жирных кислот, изомеры органических кислот, лектины)
Ингибиторы Acyl-HL сигнальной системы (например, микробные галогенные фураноны)
Ингибиторы гистин-киназ
Ферменты, деградирующие QS-аутоиндукторы (например, микробные ацилазы, лактоназы, специфические протеазы типа серпинов бифидобактерий)
Природные или синтетические аналоги различных аутоиндукторов, имитирующих сигнальные молекулы
Низкомолекулярные соединения, способные активировать или ингибировать QS регуляция прерывая ее на отдельных участках (например, микробные лактоны, лектины, микробные метаболиты полифенольных растительных соединений и т.д.)

целью сохранения биоразнообразия его микробиоты

Аутопробиотики

иммунно-микроэкологического состояния здоровья человека
*Отделение взятия биоматериала и изучения жизнеспособности присутствующих

в нем микроорганизмов до и после криоконсервации
*Отделение криоконсервирования и размораживания биоматериала
*Помещение для резервуаров с жидким азотом (-196град.) для длительного сохранения природных микробиоценозов
*Отделение по компьютерному обеспечению работы криобанка микробиоценозов человека

*Вспомогательные службы (специальный транспорт, оборудование для получения и хранения жидкого азота, виварий с безмикробными и гнотобиологическими животными и т.д.)

женщины
Лица, работающие в экстремальных условиях в течение длительного времени (сотрудники

силовых структур, летчики, подводники, космонавты , журналисты, водители общественного транспорта, бизнесмены и т.д.)
Лица, живущие или работающие в экологически неблагоприятных условиях (работники химических предприятий, атомных электростанций, участники полярных экспедиций и т.д.)
Все здоровые люди, желающие сохранить свою естественную микробиоту в течение длительного времени и при необходимости использовать ее для осуществления аутотрансплантации

созданный компанией Данон)
http://www.uspprobiotics.org
(Сайт Американского Колледжа Гастроэнтерологии)
http://www.isapp.net
(Сайт Международной Научной Ассоциации Пробиотиков

и пребиотиков)
http://www.fao.org/ag/agn/agns/micro_probiotics_en.asp
(Сайт Федерального Агентства США по безопасности и эффективности пробиотиков)
http://www.nestlefoundation.org
(Сайт, созданный компаний Нестле)