Слайд 1Тема лекции: Рост и размножение микроорганизмов. Эволюция и классификация микроорганизмов.
С.И. Похил ©
Слайд 2План лекции
Рост и размножение
микроорганизмов
Выделение чистых культур бактерий
Эволюция микроорганизмов
Классификация микроорганизмов
Слайд 3 Под ростом понимают координированное воссоздание бактериальных структур
и соответственно увеличение массы и объема микробной клетки.
Размножение - это способность микробов к самовоспроизведению, при этом увеличивается количество особей в популяции на единицу объема среды за единицу времени.
Рост и размножение бактерий
Слайд 4 Бактерии размножаются в геометрической прогрессии. Если считать, что
при оптимальных условиях бактерия удваивается каждые 30 минут, то через
час их будет 4, через два часа - 16, через 4 - 256, через 15 - миллионы. Через 35 часов их объем будет составлять около 1000 м3, а масса - свыше 400 т.
Кривая, которая описывает зависимость логарифма числа живых клеток от времени культивирования, называется кривой роста .
Слайд 5 Различают четыре основных фазы роста (размножения) периодической
культуры (периодически пересеваемой в ограниченном объеме необновляемой среды): начальную (или
лаг-) фазу, экспоненциальную (или логарифмическую) фазу, стационарную фазу и фазу отмирания.
Слайд 6 Начальная или лаг-фаза охватывает промежуток между инокуляцией бактерий
и достижением наивысшей скорости их деления. В этот период происходит
адаптация бактерий к условиям существования. В клетке в 8-12 раз возрастет количество РНК, белка, увеличивается концентрация и активность ферментов. Длительность
лаг-фазы 1,5-2 часа.
Слайд 7 Экспоненциальная (логарифмическая) фаза характеризуется постоянной максимальной скоростью деления
клеток и роста их количества в геометрической прогрессии. Она зависит
от вида микробов и состава среды. Например: кишечная палочка делится каждые 15-20 мин, стрептококки - 30 мин, а микобактерии туберкулеза - 14-16 час.
Время, на протяжении которого происходит деление микроба, называется временем генерации. Длительность логарифмической фазы - 5-6 часов.
Слайд 8 Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток
перестает увеличиваться. Наступает равновесие между количеством живых микробов и тех,
что отмирают. Этому способствует высокая плотность популяции, дефицит питательных веществ в среде, низкое парциальное давление кислорода, накопления токсичных продуктов обмена. Однако количество биомассы в этот период достигает наивысшего уровня, потому концентрацию клеток помечают как максимальную (М-концентрацию), а величину биомассы - выход или урожай. Этот признак является специфическим и характерным для каждого вида бактерий. Длится стационарная фаза 6-7 часов.
Слайд 9 Фаза отмирания (длиться от 48 часов до
нескольких недель) сопровождается резким уменьшением числа живых клеток. Этому способствуют
значительный дефицит питательных веществ в среде, нагромождения кислот, автолиз микробных клеток под воздействием собственных ферментов.
Во многих случаях необходимо поддерживать клетки в фазе экспоненциального роста и М-концентрации, потому что именно в этот период они наиболее физиологически и функционально активные: синтезируют много белка, продуцируют большое количество многообразных ферментов, токсинов, антиби-отиков, других биоактивных и полезных веществ.
Слайд 10 Это достигается постоянным удалением популяций бактерий, которые растут,
обновлением питательной среды, дополнительной аэрацией (для аэробных бактерий). Именно по
таким принципам работают биореакторы, хемостаты и турбидостаты - приборы, которые позволяют проводить непрерывное (проточное) культивирование в промышленных и лабораторных условиях.
Слайд 13Чистой культурой называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из изолированной
микробной колонии.
Слайд 14Существует 2 группы методов получения чистых культур:
1.
Методы, основанные на принципе механического разобщения клеток микроорганизмов в питательной
среде:
метод Пастера
метод Коха или «пластинчатые разводки»
метод Дригальского
с помощью микроскопа и микроманипулятора
Слайд 152. Методы, основанные на использовании биологических свойств микробов:
метод, основанный на
выделении бактерий по их подвижности
метод, основанный на применении оптимальной температуры
метод, основанный на отношении бактерий к О2 и СО2
метод применения элективных и селективных питательных сред
биологический метод
Слайд 16Выделение чистой культуры бактерий – обязательный этап бактериологичекого исследования в
лабораторной диагностике.
Наиболее часто используется метод Дригальского, который основан на механическом
разобщении клеток.
Слайд 17Метод Дригальского
1-й этап. Рассев исследуемого материала по поверхности плотной питательной
среды с целью получения изолированных колоний.
Слайд 18
Посевы «газоном» производят на плотную питательную среду в чашке Петри.
Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлёй или пипеткой наносят
посевной материал на поверхность питательного агара по методу Дригальского.
Техника посева
Слайд 19а – шпатель Дригальского;
б – положение чашки и руки
при посеве шпателем;
в – рост микроорганизмов после рассева шпателем;
г
– рост микроорганизмов после рассева петлей.
Бактериологическая петля (1) и шпатель Дригальского (2)
Слайд 20Метод секторных посевов по Голду
Слайд 222-й этап.
Макро- и микроскопическое изучение выросших колоний и отсев изолирован-
ной колонии с характерной морфологией (для определенного вида бактерий) на
скошенный
агар или в чашку Петри со
свежим агаром для
получения чистой
культуры.
Слайд 23Культуральные свойства бактерий
Колонии бактерий различаются
по величине, форме, цвету, консистенции, контуру края, структуре и характеру
поверхности:
по величине — крупные (диаметр более 4—5 мм), средние (2—4 мм) и малые (1—2 мм);
по форме — круглые, розеткообразные, листовидные и т. д.;
по цвету, зависящему от пигмента — белого, желтого, зелено-синего, красного цветов и т. д.;
по консистенции — сухие, влажные, сочные, слизистые;
по поверхности — гладкие, морщинистые, исчерченные, плоские, выпуклые, плосковыпуклые, вдавленные;
по краю — с ровными, волнистыми, бахромчатыми краями;
по структуре — могут иметь аморфную, зернистую, волокнистую внутреннюю структуру;
в чистой культуре, выращенной на скошенном питательном агаре, характер роста может быть сухим, влажным, ползучим, складчатым, пигментированным.
Слайд 25Среда Эндо. Посев по Голду. Получены изолированные колонии для выращивания
чистой культуры.
Слайд 26Культуральные свойства бактерий
(продолжение)
Streptomyces
Рост
изолированных колоний
Klebsiella pneumoniae
Слайд 27S.аureus на кровяном агаре
Колонии Bacillus anthracis
«голова медузы»
Колонии возбудителя чумы
Y. pestis
«кружевной платочек»
Культуральные свойства бактерий (продолжение)
Слайд 28Культуральные свойства бактерий. Пигменты.
Рост чистой культуры S. marcescens.
Рост чистой
культуры S. aureus
Слайд 293-й этап.
Задача 3 этапа – идентификация-
определение вида
выделенной чистой культуры по комплексу
биологических свойств:
Морфологических
Тинкториальных (окраска
по Граму)
Культуральных
Биохимических
Антигенных
Чувствительности к типовым диагностическим фагам
Чувствительности к антибиотикам и др. лекарственным препаратам
Слайд 30Биохимическая идентификация выделенной
чистой культуры заключается в определении спектра ее
ферментативной активности на дифференциально-диагностических средах содержащих компоненты, изменение которых позволяет
оценить спектр ферментов у исследуемой культуры микроорганизмов.
Традиционно дифференциально-
диагностические среды разливались в бактериологические пробирки, в которых после посева микроорганизмов и определялась их биохимическая активность.
Слайд 31Состав: МПА, набор углеводов, индикатор
Принцип действия: при ферментации углевода образующиеся
кислые продукты изменяют рН, при этом изменяется окраска индикатора
Дифференциально-диагностические углеводные
среды Гисса:
Слайд 32Современные ускоренные методы определения биохимической активности микроорганизмов с использованием миниатюризированных
дифференциально-диагностических тест-систем Enterotubes Roche
Тест-система с плотными дифференциально -диагностическими средами засевается
чистой культуры бактерий путем протягивания инокуляционного стержня, инкубируется в термостате с последующей оценкой результатов биохимических реакций.
Слайд 33Пример определения ферментативной активности бактерий на тест-системах api
Тест-система с сухими
дифференциально -диагностическими средами заполняется суспензией из чистой культуры бактерий и
инкубируется в термостате.
Слайд 34Вид системы для энтеробактерий после инкубации. Верхний планшет – все
тесты положительны, нижний – все отрицательны.
Вид системы для стафилококков после
инкубации. Верхний планшет – все тесты положительны, нижний – все отрицательны.
Слайд 36ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ НЕКОТОРЫХ РОДОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ.
Слайд 37Учет результатов определения чувствительности выделенного микроорганизма к антибактериальным препаратам.
Выдача бактериологичес-
кого
заключения
Слайд 39Архейская эра
Архейская эра (древнейшая) существо-вала 3,5 млрд. лет назад,
продолжительность эры 900 млн. лет
Климат и среда
Активная вулканическая деятельность. Анаэробные (бескислородные) усло-вия жизни в мелководном древнем море. Развитие кислородосодержащей атмосферы.
Слайд 40Развитие органического мира
В архейской эре возникли первые живые организмы.
Они были гетеротрофами и в качестве пищи использовали органические соединения
«первичного бульона». (В осадочных породах древностью 3,5 млрд. лет обнаружены биополимеры). Первыми жителями нашей планеты были анаэробные бактерии.
Слайд 41Анаэробы, гликолиз
Представление о том, что первыми формами жизни были анаэробы,
получающие энергию в процессе брожения за счет субстратного фосфорилирования ,
согласуется с общей теорией происхождения жизни, выдвинутой А.И. Опариным и Дж. Холдейном. Наиболее древними из существующих эубактерий, вероятно, являются группы организмов, получающие энергию в результате функционирования гликолитического пути сбраживания углеводов. Можно предполагать, что гликолиз - первый сформированный механизм получения клеточной энергии.
Основная проблема на этом этапе сводилась к тому, чтобы создать "ловушки" для возникающего при окислительных преобразованиях субстрата водорода.
Слайд 42Органические субстраты
Источником энергии и всех органических соединений, необходимых для построения
веществ клетки, первоначально служили органические субстраты абиогенного происхождения. Поскольку извлечение
энергии из органического субстрата (преимущественно углеводов) при его метаболизировании по гликолитическому пути было весьма незначительным, это привело к довольно быстрой переработке доступных органических субстратов и обеднению ими окружающей среды.
Слайд 43Метаболические системы (свет+углекислота)
Поиск новых источников энергии и углерода привел к
созданию метаболических систем, осуществляющих использование света и углекислоты. Важными моментами
в формировании механизма использования световой энергии были: создание фоторецепторов, сформирование фотосинтетической цепи переноса электронов и нового механизма фосфорилирования, сопряженного с переносом электронов.
Использование углекислоты в качестве основного или единственного источника углерода привело к созданию эффективного циклического механизма ее фиксации - восстановительного пентозофосфатного цикла, расширившего конструктивные возможности живых организмов.
Слайд 44Эубактериальные формы
Таким образом, на этом этапе
эволюции прослеживается
четкая тенденция
создания энергетических и конструктивных
систем, обеспечивающих наибольшую
независимость существующих эубактериальных
форм от внешней среды.
Вершина эволюции в этом направлении - цианобактерии, у которых такая независимость достигается максимально за счет создания механизма, позволяющего использовать воду в качестве донора электронов.
Слайд 45Цианобактерии
С цианобактериями связаны два момента, оказавшие решающее влияние на дальнейший
ход эволюции эубактерий.
Первый обусловлен появлением молекулярного кислорода.
Второй - тем,
что цианобактерии явились на Земле первыми интенсивными продуцентами органического вещества.
Появление О2 открыло новые возможности для совершенствования системы получения живой клеткой энергии из химических соединений. Формируется способ получения энергии, основанный на глубоком окислении неорганических и органических соединений окружающей среды.
Органические соединения - теперь соединения, имеющие биогенное происхождение.
Этот способ связан с созданием новой системы электронного транспорта и сопряженного с ней механизма фосфорилирования.
В группах эубактерий обнаружено огромное разнообразие типов жизни, у которых основным источником энергии служит окислительное фосфорилирование.
Слайд 47Таким образом, все современные способы получения энергии живыми организмами сформировались
на уровне прокариотной клеточной организации и их становление может быть
прослежено в эубактериальной ветви. В процессе дальнейшей эволюции развитие получили только наиболее совершенные варианты.
Слайд 48Систематика бактерий
Систематика (таксономия) бактерий является одним из наиболее важных и
сложных, но менее разработанных разделов микробиологии.
Задачами систематики являются классификация, номенклатура
и идентификация организмов.
Слайд 49Классификация – распределение множества организмов по группам (таксонам).
Номенклатура – присвоение
названий отдельным группам и видам микроорганизмов.
Слайд 50В систематике бактерий, так же как и в ботанике, зоологии,
принята бинарная номенклатура, согласно которой бактериям присваивается название, состоящее из
двух слов: первое определяет их принадлежность к конкретному роду, второе – к виду.
Например, Clostridium botulinum и Clostridium tetani – два различных вида бактерий, относящихся к одному роду.
Слайд 51Основной таксономической категорией является вид.
Вид – это эволюционно сложившаяся
совокупность особей подобного (не менее 70 %) генотипа , обладающих
выраженным фенотиповым сходствм (по морфологии, физиологии, биохимии и др.), что позволяет отличить его от других видов.
Виды объединяются в роды, роды – в семейства, семейства – в порядки, далее следуют классы, отделы, царства, домены.
Слайд 52В микробиологии существуют также более мелкие таксономические единицы, чем вид:
подвид (subspeciens), разновидность. Подвиды могут различаться по физиологическим (biovar), морфологическим
(morphovar), антигенным (serovar),
по генетическим (genovar) свойствам.
Слайд 53Клон и штамм
Большое значение в микробиологии имеют такие
понятия, как:
клон – чистая культура, полученная из одной клетки;
штамм –
культура бактерий одного вида, выделенная из различных источников либо из одного источника в разное время или полученная в ходе генетических манипуляций.
Слайд 54Идентификация
установление принадлежности микроорганизмов к определенному таксону (виду, роду,
семейству и др.) на основании наличия (выявления) конкретных признаков.
Слайд 55 В настоящее время в микробиологии приняты два
различных подхода к систематике, обусловливающих существование двух систем классификации:
филогенетической (естественной,
природной);
фенотипической (искусственной).
Слайд 56Филогенетическая классификация
В основу положена идея создания системы
прокариот, объективно отражающей родственные отношения между разными группами бактерий и
историю их эволюционного развития.
Слайд 57Фенотипическая классификация
Преследует, в первую очередь, практические цели,
заключающиеся в том, чтобы быстрее установить принадлежность микроорганизма к определенному
таксону (чаще всего к виду).
Слайд 58 При классификации бактерий учитывается большое
количество различных свойств и признаков (морфология, отношение к окраске по
Граму, биохимическая активность, антигенные особенности и др.).
Свойства и признаки, характерные для всех бактерий данной группы и нехарактерные для микроорганизмов других групп, называют критериями систематики.
Слайд 59 Чем больше общих признаков имеют сравниваемые
организмы, тем больше и оснований для включения их в одну
таксономическую группу.
Слайд 60 В связи с тем что количество
признаков, используемых для классификации микроорганизмов, значительно возросло, в конце 50-х
годов ХХ века возникла нумерическая (численная) таксономия, основанная на принципах классификации французского ботаника М. Адансона (1757).
Слайд 61 В основе нумерической таксономии лежит принцип сопоставления организмов
по возможно большему количеству учитываемых признаков при допущении, что все
они для систематики равноценны.
Слайд 62 При точной идентификации бактерий приоритетным
является использование генетических (молекулярно-биологических), фенотипических и серологических подходов и критериев
систематики.
Слайд 63Генетические критерии систематики
Наиболее объективными
и дающими представление о филогенетических связях между микроорганизмами являются генетические
(молекулярно-биологические) критерии.
К ним относятся:
определение относительного содержания Г+Ц-пар в ДНК,
гибридизация нуклеиновых кислот (ДНК/ДНК, ДНК/РНК)
определение нуклеотидных последовательностей в молекулах ДНК или РНК,
применение генетических зондов (ДНК-зондов),
рестрикционный анализ ДНК,
методы генетического анализа (изучение переноса генов, генетических скрещиваний, картирование хромосом бактерий и др.)
Слайд 64Фенотипические критерии систематики
В классификации бактерий используют
набор фенотипических признаков:
морфологических,
культуральных,
физиологических,
биохимических,
серологических (антигенных).
Слайд 65Морфологические признаки
Описание морфологических признаков включает определение
формы, размеров клеток и их взаимного расположения, типа жгутикования, наличия
капсулы, способности образовывать споры, особенностей внутреннего строения бактериальной клетки.
Слайд 66Культуральные признаки
При характеристике культуральных признаков, т. е. таких,
которые проявляются при выращивании бактерий в различных условиях, отмечают особенности
роста бактерий на плотной питательной среде (размер, окраска, форма, характер колоний) и в жидких питательных средах (образование осадка, пленки, взвеси, хлопьев и т. д.).
Слайд 67Физиологические признаки
К числу физиологических признаков относятся
возможность использовать те или иные источники углерода и азота, потребность
в факторах роста, тип энергетических процессов (аэробное и анаэробное дыхание, брожение), отношение к температуре, влажности, кислотности среды и другим факторам внешней среды.
Слайд 68Биохимические признаки
Разнообразными являются биохимические признаки
бактерий, которые обусловлены наличием тех или иных ферментов, образованием определенных
продуктов метаболизма (кислоты, спирты, газы и др.), типом запасных веществ, химическим составом клеток и т. д.
Слайд 69Серологические (антигенные) критерии систематики
Серологические (от
лат. serum – сыворотка) критерии систематики основаны на специфических реакциях
взаимодействия антигенов (компоненты клеточных стенок, жгутиков, капсул, ДНК и токсинов) идентифицируемых микроорганизмов с антителами, содержащимися в диагностических сыворотках (или иммуноглобулинах).
Между антигенами и соответствующими им антителами происходит связывание, что положено в основу методов серологической идентификации микроорганизмов.
Слайд 70Современная систематика бактерий
Живые организмы, по современным представлениям, могут быть
распределены по трем ДОМЕНАМ, два из которых «заселены» микроорганизмами: бактерии
и археи.
К микроорганизмам относят также микроскопические грибы и простейшие, являющиеся низшими эукариотами
Слайд 71Taксономические группы бактерий согласно Определителю по систематике бактерий Берджи (Bergey’s
Manual of Systematic Bacteriology; 5 томов; 1том – вышел в
2002 г.).
Том 1A: Домен Archaea
примитивные, адаптированные к существованию в экстремальных условиях бактерии не имеющие медицинского значения.
Том 1B: Домен Bacteria
Том 2-5:
Тип Proteobacteria – грамотрицательная клеточная стенка (известно более 400 родов и 1300 обозначенных видов)
Тип Firmicutes – в основном грамположительные бактерии с низким содержанием G + C (менее 50 %)
Тип Actinobacteria – грампозитивные бактерии с высоким содержанием G + C (более 50 %)
Слайд 72 Патогенные для человека и животных бактерии принадлежат к
домену ”Bacteria” и царству “Monera (Procaryotae)“.