Презентация на тему Злокачественный рост Инвазия, метастазирование Интенсивное и неограниченное во

Злокачественный рост

Инвазия,
метастазирование

Интенсивное и
неограниченное во времени деление клеток

Солидные опухоли
(раки, саркомы и др.)

Блок дифференцировки

Острые лейкозы

Злокачественность лейкозов детерминируется блоком дифференцировки неопластических клеток, подавлением нормального кроветворения и возникающей в связи с этим недостаточностью функции костного мозга (гибель больных от инфекций, кровотечений и т.д.)

Блок дифференцировки
класс 2

Стимуляция размножения,
подавление апоптоза (класс 1)

Мутации FLT3,
Мутации RAS,
Мутации c-KIT,
TEL-PDGFRb,
BCR-ABL и др.

AML1-ETO,
CBFb-SMMHC,
RARa-PML,
TEL-AML1;
Мутации AML1, PU.1,
GATA1, C/EBPa и др.

Острый лейкоз

Ретиноевая кислота

RARa/RXRa

G-CSF, IL-6, первичные
гранулярные белки и др.

лактоферрин, желатиназа,
коллагеназа, липокалин и др.
вторичные гранулярные белки

Гранулоцитарная
дифференцировка

RUNX1 (AML1/CBF)

миелопероксидаза,
M-CSFR, GM-SCF,
IL-3, CD36 и др.

Ранняя миелоидная
дифференцировка

GM-CSFR, G-CSFR,
CD11b и многие др.

Цитокины

C/EBPe

C/EBPa

PU.1

Ранняя миелоидная дифференцировка и ее нарушение при остром миелобластном лейкозе

Cтволовая
клетка

В-клетка

Т-клетка

Моноцит

Мутации AML1
(ОМЛ-М0)

Общий миелоидный
предшественник

Гранулоцит

Тромбоциты

Эритроциты

Общий
лимфоидный
предшественник

Мультистадийная схема развития лейкозов

T. Shima et al. Experimental Hematology 2014;42:955–965

Курс «Биология опухолевой клетки»
(2019 г.)

Лекция 8

Опухолевый супрессор р53: как один белок контролирует многие аспекты канцерогенеза

Н.Л. Лазаревич

“p53 is a protein of many talents ...”
K.Vousden, Cell, 2000

В PubMed число публикаций про p53 на 28.11.2019 - 97931

Дисфункция р53 (мутации и др. аномалии) –
наиболее универсальное молекулярное изменение
в опухолях человека. Она характерна для большинства новообразований 50 разных типов.

Врожденные мутации р53 в половых клетках
ведут к синдрому Ли-Фраумени – наследственной
предрасположенности к развитию в молодом
возрасте сарком, рака молочной железы, опухолей
мозга, лимфолейкозов, и других новообразований.

Манипуляции с геном р53 у мышей:

Гомозиготный нокаут гена р53 приводит к развитию новообразований в молодом возрасте у 95-100% животных

Манипуляции с геном р53 у мышей:

Гомозиготный нокаут гена р53 приводит к развитию новообразований в молодом возрасте у 95-100% животных;
2) У животных, экспрессирующих мутантный (m) “гиперактивный” р53, опухоли не возникают, но наблюдается преждевременное старение.

p53+/+

P53+/m

20 недель

Выживаемость

Возраст (недели)

Возраст

3) У трансгенных животных с дополнительной копией нормального гена р53 ниже вероятность развития опухолей (спонтанных и индуцированных химическими канцерогенами). При этом нет преждевременного старения

Манипуляции с геном р53 у мышей:

Мыши без опухолей, %

Время после введения метилхолантрена
(недели)

p53+/+

p53+/+/+

p53+/+

p53+/+/+

Выживаемость в 2 года, %

100

50

0

78%

75%

Структурные домены
полноразмерного р53

Сиквенс-специфическое
связывание ДНК
4 x PuPuPuCA/TA/TGPyPyPy

Олиго-
мери-
зация

Регу-
ляция

ТA1

1-42

64-92

102-306

307-355

364-393

P

Ac

P

P

P

P

P

Ac

P

P

Ac

- сайты фосфорилирования;

- сайты ацетилирования

NLS

ТA2

Транс-
активация

P

P – пролин-богатый домен (взаимодействие с другими белками)

43-63

Изоформы р53

53 kD

45 kD

46 kD

47 kD

41 kD

42 kD

35 kD

25 kD

26 kD

(специфична для грызунов)

p53

p53b

p53g

D40 p53(p47)

D40 p53b

D40 p53g

D133 p53

D133 p53b

D133 p53g

D p53

p53as

полноразмерный

альтернативный сплайсинг (интрон 9)

альтернативный сплайсинг (интрон 9)

альт. сплайсинг (интрон 2) / альт. инициация трансляции (экзон 4)

альт. сплайсинг (интроны 2,9) / альт. инициация трансляции (экзон 4)

альт. сплайсинг (интроны 2,9) / альт. инициация трансляции (экзон 4)

внутренний промотор (интрон 4)

внутренний промотор (интрон 4) / альт. сплайсинг (интрон 9)

внутренний промотор (интрон 4) / альт. сплайсинг (интрон 9)

альтернативный сплайсинг (экзоны 7- 9)

альтернативный сплайсинг (интрон 10)

Конформация молекул белка р53 претерпевает значительные изменения

В зависимости от приобретаемой конформации р53 способен:

Повышать транскрипцию определенных генов;
Подавлять транскрипцию ряда генов;
Стимулировать репарацию ДНК;
Подавлять репликацию ДНК вирусов;

Конформация и функции р53 регулируются фосфориливанием, ацетилированием, убиквитинированием, сумоилированием, неддилированием, метилированием, окислением и др.

Конформация и функции р53 регулируются фосфо-риливанием, ацетилированием, убиквитинированием, сумоилированием, неддилированием, метилированием, окислением и др. Вызываемые этими событиями модификации конформации р53 изменяют его способность связываться с другими белками и ДНК

а) фосфорилирование N-конца (Ser15, Ser20),
дефосфорилирование Thr55,
ацетилирование С-конца (Lys373, Lys382) и/или
метилирование С-конца (Lys372)
увеличивают время жизни/содержание и активность р53

Mdm2

Убиквитинирование
и деградация

Mdm2

Ser20

р53

р53

Lys373

P

P

Ser15

Lys382

Ac

Ac

Mт

Lys372

Thr55

P

Убиквитинирование
и деградация

б) фосфорилирование Ser33, Thr81, Ser315 вызывает взаимодействие с белком Pin1 (пролин-пептидил-цис/транс-изомеразой).
В результате меняется конформация р53 и увеличивается его время жизни и способность связываться с определенными последовательностями ДНК;

P

Слабое
связывание
с ДНК

P

P

P

Сильное
связывание
с ДНК

г) восстановление Сys275 и Cys277, осуществляемое белком Ref1, увеличивает способность р53 репарировать ДНК

в) сумоилирование Lys385 изменяет транскрипционную активность р53

Mdm2

Mdm2

Mdm2

Kruse and Gu, 2009, Cell, May 15, v. 137, pp. 609-622

Kruse and Gu, 2009, Cell, v. 137, pp. 609-622

p53

CBP/p300

p53

CBP/p300

Ac

5’-RRRC(A/T)(A/T)GYYY-3’-(0-13 bp)-5’-RRRC(A/T)(A/T)GYYY-3’

Ацетилирование
гистонов

Транс-активация

Повреждение ДНК

Гипоксия

p53

Sin3A

p53

p53

Деацетилирование
гистонов

p53

Sin3A

Транс-репрессия

Трансляция
Время жизни

5’-RRRCGTGYRY-3’-(3 bp)-5’-YRRCATGYYY-3’

5’-YRRCTAGYYY-3’-(3 bp)-5’-YRYCTTGRYY-3’

Зависимость пост-трансляционных модификаций р53 и изменений его транскрипционной активности от типа стресса

P

Ser15

P

Ser15

Ser15

Ser15

Ser15, Ser20, Ser33,
Ser46, Thr81, Ser315

p53

p53

«Латентная»
форма

Ac

p53

«Репарационная»
форма

Lys373,Lys382

«Cтрессовые»
формы

Сys275,
Сys277

Регуляция экспрессии генов,
контролирующих
антиоксидантную защиту;
движение и адгезию клеток;
подавление репликации вирусных ДНК

Репарация ДНК

Повреждения ДНК,
стрессы

Селен

Изменения экспрессии генов,
индуцирующие:
арест клеточного цикла;
апоптоз

O

O

Сys275,
Сys277

Пост-трансляционные модификации регулируют биологические активности р53

P

P

P

P

Ac

р53

Некоторые гены-мишени р53 и регулируемые ими биологические функции (всего в геноме человека ~450 сайтов связывания р53)

BAX,
PUMA,
p53AIP1,
PIG3,
Fas/APO1,
Killer/DR5,
APAF1,
Скотин,
PTEN
Сурвивин
BCL2
SESN1,
SESN2

p21WAF1,
14-3-3s,
Reprimo,
BTG2,
B99
PTGF-b,
Cdc2,
Циклин B,
Cdc25A
EKT2
DP1
miR34

SCO2,
PGM
Tsp1,
Tsp2,
SEMA3F,
BAI-1
GD-AIF
a2HP
Маспин
HIF-1,
VEGF

HGF/SF,
HGF1/MSP,
MET(HGF-R),
HB-EGF,
EGF-R,
CD44,
Фибронектин,
SDF-1
Notch1
MCK,
SMA-a,
Nanog и др.

SESN1,
SESN2,
GPX1,
SOD2
p53R2
GADD45,
DDB2,
XPC,
XPE
XPG
DNA pol k

Миграция и
дифференци-
ровка клеток

Детоксикация
радикалов и
репарация ДНК

Апоптоз,
аутофагия

Остановка
клеточного
цикла

Подавление
гликолиза и
ангиогенеза

Mdm2

Wip1

Петли
негативной
авторегуляции

Pirh2,
COP1

Функции «латентного» p53:

1. Антиоксидантная защита

(Sablina et al., Nature Med., 2005)

Инактивация р53 понижает экспрессию генов сестринов и глютатион-пероксидазы и, как следствие, повышает содержание кислородных радикалов

Hi95

PA26

GPx

печень тонкий кишечник

Hi95

GPx

PA26

GPx

wt
p53-/-

wt
p53-/-

wt
siRNA

Клетки RKO:

Выключение экспрессии р53 в клетках
человека с помощью РНК-интерференции

0

10

20

30

40

50

60

Спленоциты

Фибробласты
селезенки

p53-/-

0

50

100

150

200

250

RKO

HEF

WI38

BJ

IMR90

Флюоресценция DCF
(уровень ROS)

контроль

sip53

контроль

Фибробласты
легкого

Нокаут гена р53 у мышей

р53

Функции «латентного» p53:

2. Участие в регуляции морфологии и движения клеток

Функции «латентного» p53:

3. Участие в регуляции дифференцировки

Транс-дифференцировка фибробластов в миофибробласты

aSMA

контроль

TGFb

контроль

TGFb

p53

BJ/
si-p53

BJ

IC-Notch

Контроль

si-p53 + IC-Notch

Функции «латентного» p53:

4. Участие в регуляции плюрипотентности

Уровень р53 определяет результаты конкуренции гемопоэтических стволовых клеток и предшественников

Bondar and Medzhitov, Cell Stem Cell, 2010, v. 6, p. 309-322

p53

«Латентная»
форма

Детоксикация мутагенных радикалов; репарация ДНК;
регуляция репликации ДНК и центросом

Регуляция дифференцировки
и миграции клеток

Активация чекпойнтов,
остановка клеточного цикла

Апоптоз,
подавление ангиогенеза

P

p53

Ac

P

«Стрессовые»
формы

Повреждения,
стрессы

ATM/ATR,
CHK1/2 и др.

Повреждения
ДНК

Активация
онкогенов,
вирусная
инфекция

Оксидативный
стресс, гипоксия, NO,
гипо- и гипертермия

Изменения
архитектуры
клетки

p53

Наборы генов, экспрессия которых изменяется
вследствие активации р53, зависят от типа стресса

(Microarray analysis, HCT116 p53+/+ vs. HCT116 p53-/-)

Функции активированного (“стрессового») p53:

1. Остановка в G1

pRb

E2F

pRb

E2F

DP1

Циклин Е/Cdk2

P

P

DP1

Вход в S фазу

Активированный
р53

p21Waf1/Cip1

Циклин D/Cdk4

Myc

P

Функции активированного (“стрессового») p53:

2. Остановка в G2

Cdc2

Вход в митоз

Активированный
р53

p21Waf1

14-3-3s

Cdс2

Циклин B

14-3-3s

Цитоплазма

Gadd45

Gadd45

Cdc2

Cdc2

Циклин B

Циклин B

Функции активированного (“стрессового») p53:

3. Остановка в S

D p53

альтернативный сплайсинг (экзоны 7- 9)

p53

Циклин A/Cdk2

Активированный
D р53 (P-Ser15 и др.)

p21Waf1/Cip1

Продвижение по S фазе

Время после повреждения ДНК в G1 S
(часы)

Повреждение ДНК в S

0

20

4

8

12

16

р53

p21Waf1/Cip1

p21Waf1/Cip1

D р53

p53 активен в S, но не в других фазах цикла

p53 не активирует апоптоз

Функции активированного (“стрессового») p53:

4. Индукция апоптоза

Апоптоз

р53

Каспазы 3,6,7

Bax

Bcl2

PIG3

p53AIP

Puma

PIDD

Fas

Killer/DR5

Увеличение
проницаемости
митохондриальной
мембраны

Каспаза 9

Каспаза 8(10)

Apaf1

Сурвивин (IAP)

Функции p53:

5. Регуляция аутофагии

Galuzzi et al., Cell Cycle, 2010, 9:2, 250-255

Сells with low autophagic rates show a p53-dependent increase in autophagy in response to starvation, whereas cells with high autophagic rate show a p53-dependent decrease in autophagy in response to the same conditions — the end result in both cases is the promotion of cell survival

Scherz-Shouval et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA 107:18511–18516;
Maddoxs and Vousden, 2011, J Mol Med, 89:237–245.

Green and Kroemer, Nature. 2009;458(7242):1127-1130

Функции p53 не ограничиваются регуляцией транскрипции

Отличия функциональных активностей
активированных (“стрессовых») изоформ p53

p53

D p53

альтернативный сплайсинг (экзоны 7- 9)

D p53 - активирует p21Waf1/Cip1, 14-3-3s, но не MDM2, BAX, PIG3

активирует p21Waf1/Cip1; сильнее чем р53 активирует BAX,
очень слабо активирует MDM2

D133 p53

внутренний промотор (интрон 4)

D133 p53

ингибирует активацию р53-респонсивных генов
(доминантно-негативный эффект)

p53b

альтернативный сплайсинг (интрон 9)

p53b

При активации полноразмерного р53 судьба клетки (апоптоз или остановка цикла) зависит от:

Не все р53-респонсивные элементы имеют одинаковую аффинность к р53. p21WAF1 и Gadd45 активируются при значительно меньшем уровне р53. Поэтому, мало р53 - остановка цикла; много – апоптоз

Остановка делений

Апоптоз

1. Количественного уровня р53

2. характера модификаций молекул р53
а) сайтов фосфорилирования

При активации р53 судьба клетки (апоптоз или остановка цикла) зависит от:

Ser15

P

P

Ser20

Ser46

p53

WAF1

Ser15

P

P

Ser20

Ser46

p53

WAF1

AIP1

P

Остановка
в G1

Апоптоз

Ac

Ac

Ser15

P

P

Ser20

p53

Ser15

P

P

Ser20

p53

P

Повреждение ДНК

p53

«Латентный»

3-6 час

Сильное
повреждение ДНК

p21Waf

AIP1 и др.

Остановка
в G1

Апоптоз

Ser46

p53DINP

8-12 час

Ac

Ac

Kruse and Gu, 2009, Cell, v. 137, pp. 609-622

2. характера модификаций молекул р53
б) уровня и специфики ацетилирования

При активации р53 судьба клетки зависит от:

3. Экспрессии ко-факторов транскрипции, избира-
тельно усиливающих ту или иную функцию р53

При активации р53 судьба клетки (апоптоз или остановка цикла) зависит от:

При связывании р53 с ASPP (TP53BP) -1 и -2 повышается его аффинность к респонсивным элементам, содержащимся
в проапоптозных генах

Остановка делений

Апоптоз

ASPP

При связывании с Hzf (ZNF385), наоборот, уменьшается аффинность к респонсивным элементам, содержащимся в проапоптозных генах, и увеличивается способность активи-ровать гены, продукты которых останавливают клеточный цикл

p53

HIF-1

VEGF

VEGF

Tsp1

Tsp1

эндотелиоцит

Некоторые р53-зависимые механизмы
подавления ангиогенеза

Подавление размножения
и/или апоптоз

фибробласт,
эпителиоцит

H2O2

a(II)Ph

Активированный р53 препятствует накоплению
генетических повреждений в эмбриональных
стволовых клетках путем репрессии гена Nanog

Nanog необходим для самоподдержания ES-клеток,
при его репрессии – дифференцировка.

P

P

Ser315

p53

Ac

P

P

P

Ser315

p53

Ac

P

Sin3A

Nanog

Репрессия

Дифференцировка
ES-клеток

Повреждение ДНК

Bojesen and Nordestgaard, Cell Cycle, 2008, 7:158-163

У людей c аллелем р53 Pro72, менее способным индуцировать апоптоз, продолжительность жизни больше на ~3 года
(данные получены на датской популяции, n=9912)

У мышей, экспрессирующих мутантный (m) “гиперактивный” р53,
опухоли не возникают, но наблюдается преждевременное старение

Инактивация функции 53

Повышение содержания кислородных радикалов
Ослабление G1- и G2-чекпойнтов
Подавление индукции апоптоза
Ослабление репарации ДНК
Стимуляция ангиогенеза и васкулогенной мимикрии
Гликолитический тип дыхания
Повышение активности теломеразы
Увеличение экспрессии маркеров плюрипотентности

Мутагенез
Нечувствительность к рост-супрессирующим сигналам
Увеличение пролиферативного потенциала (“иммортализация”)
Увеличение доли клеток со свойствами ОСК

Нарушения
функции р53

Нормальная
клетка

Опухолевая
клетка

Резкое увеличение вероятности
возникновения новообразования
(синдром Ли-Фраумени и др.)

Прогрессия новообразования
(увеличение агрессивности,
устойчивость к химиотерапии)

Пути инактивации р53 в опухолевых клетках:

1) Мутации гена р53
- 30-60% опухолей разной локализации.
2) Амплификация и гиперэкспрессия онкогена Mdm2
- 15-25% остеосарком и фибросарком.
3) Экспрессия онкобелка Е6
- HPV-позитивные раки шейки матки.
4) Нарушения транспорта р53 в ядро
- большая часть нейробластом и 10-15% раков молочной железы (взаимодейсвтие с эстрогеновыми рецепторами).
5) NF-kB-зависимое подавление функциональной активности р53
- подавляющее большинство раков почки

% опухолей
3-4 стадий с
мутациями
р53

250 200 150 100 50 50 100 150 200 250

Число случаев (х1000) с мутациями р53

Развивающиеся страны Развитые страны

Рак легкого

Рак толстой кишки

Рак молочной железы

Мутации р53 - наиболее универсальное
молекулярное изменение в опухолях человека

Рак желудка

70%
65%
45%
61%
30%

Рак мочевого пузыря

В отличие от других опухолевых супрессоров, большинство мутаций р53 являются миссенс-мутациями, приводящими к
замене аминокислотных остатков

Распределение мутаций р53 в опухолях человека по кодонам
(все типы новообразований)

Миссенс-мутации

Число случаев

Другие мутации

400
350
300
250
200
150
100
50

50

273

248

175

кодоны р53

281

Олигомеризация,
регуляция
связывания ДНК

100 200 300 394

Транс-активация,
регуляция
стабильности

Связывание специфических
последовательностей ДНК

«Горячие точки» мутаций р53 при разных формах опухолей

«Мутантный»

«Стрессовый»

Онкогенные
мутации

«Латентный»

Доступные для антител эпитопы

Недоступные/разрушенные эпитопы

P

Ac

P

Наиболее характерные для опухолей мутации необратимо изменяют конформацию белка, что позволило получить антитела, различающие нормальные и мутантные формы р53

P

Наиболее характерные для опухолей мутантные р53 инактивируют продукт неизмененного аллеля за счет образования транскрипционно-неактивных тетрамеров

Мутантный
р53

Доминантно-
негативный эффект

Новые активности

Воздействие на р53-независимые
механизмы регуляции клеточного
цикла, апоптоза и т.д.

Инактивация р53-зависимых путей
регуляции антиоксидантной защиты, клеточного цикла, апоптоза и т.д.

Гомологи р53:

November 28, 2019

97931

4986

2448

Гомологи р53:

~25%

~65%

~35%

р53

р63, p73

TAα

TAβ

TAγ

DNα

DNβ

DNγ

Транс-
активация

ДНК-связывание

Олигоме-
ризация

РНК каждого из генов, р63 и р73, экспрессируется с двух промоторов и подвергается альтернативному сплайсингу.
В результате образуется как минимум 6 изоформ белка р63 и 14 изоформ белка р73, обладающих (ТА) или не обладающих (DN) способностью транс-активировать р53-респонсивные гены и индуцировать остановку клеточного цикла и апоптоз.

Нокаут у мышей:

p53-/-

p63-/-

p73-/-

~Нормальное развитие,
опухоли у 100% мышей
в возрасте до 1 года:
лимфомы, саркомы и др.

Гибель после
рождения:
отсутствие кожи и др. эпителия

Жизнеспособные мыши с расстройствами зрения, слуха, поведе-ния. Нет вомероназаль-ного органа.
Отсутствие опухолей в возрасте до 2-х лет.

Экспрессия:

Активация:

Опухоли:

p53

p63

p73

Клетки
всех тканей

Стволовые и недифференци-
рованные клетки ряда тканей
(в основном DN формы)

Самые разные
стрессы

Некоторые стрессы

Инактивация

Повышение экспрессии
DN форм

p53

p53

DNp63/73

Конкуренция с р53

Секвестрирование p53

ТАp73

ТАp63

p53-респонсивный ген

p53-респонсивный ген

p53-респонсивный ген

DNp63/73

Kastenhuber and Lowe, 2017.
Putting p53 in Context.
Cell, 170: 1062-1078

Курс «Биология опухолевой клетки»
(2019 г.)

Лекция 9

Эндогенные и экзогенные канцерогенные факторы

Н.Л. Лазаревич