Метод ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний

гена или его фрагмента в условиях in vitro. Реакционная смесь

для получения нужной ДНК содержит: исследуемую ДНК-матрицу, субстраты реакции – 4 дНТФ, 2 праймера, термостабильную Taq-полимеразу и реакционный буфер (кофактор – Mg2+).

В 1983 году Кэри Мюллис с сотрудниками разработал метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР).

30 нуклеотидов), выполняющие функцию «затравок» при ферментативном синтезе ДНК. В

ПЦР обычно используют 2 праймера, которые комплементарны 3'-концевым последовательностям амплифицируемого участка на обеих нитях ДНК-матицы соответственно. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых фрагментов ДНК.

Термостабильные бактерии Termus Aquaticus

исходная смесь нагревается до 94°С, при этом нити ДНК расходятся;

Отжиг – на этом этапе Т реакционной смеси снижается до 52 – 60°С и происходит комплементарное связывание праймеров с нитями матричной ДНК;

Полимеризация, в ходе которой Taq-полимераза катализирует удлинение праймеров (с 3'-конца) и синтез новых цепей ДНК. Т смеси для проявления оптимальной активности Taq-полимеразы соответствует 72°С.

приборе – амплификаторе (термоциклере), что позволяет получить огромное количество копий

нужного фрагмента ДНК. Так, в результате проведения 20 циклов ПЦР анализируемый участок ДНК амплифицируется более чем в миллион раз.

диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявлять этиологию инфекции, даже

если в пробе содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов, клещевого энцефалита, туберкулеза, венерических заболеваний и т.д.

Этот метод имеет большое значение для мониторинга и оценки эффективности терапии, особенно при вирусных заболеваниях. Определение «вирусной нагрузки» позволяет осуществить индивидуальный подбор дозы противовирусных препаратов. При помощи ПЦР удается выявить отдельные субтипы и штаммы вирусов и бактерий, обладающих повышенной устойчивостью к тем или иным лекарственным препаратам.

прямого секвенирования.
Такой подход является наиболее информативным при диагностике внутриклеточных

паразитов и медленнорастущих микроорганизмов, требующих сложных условий культивирования, например, возбудителей туберкулеза – Mycobacterium tuberculosis.

bovis, Mycobacterium africanum и Mycobacterium microti), поэтому в последние десятилетия

интенсивно развиваются молекулярно-генетические методы диагностики туберкулеза, определения лекарственной устойчивости и типирования штаммов микобактерий туберкулеза.

для всех 4 видов группы туберкулеза.
Часто для этих целей

используют праймеры для выявления последовательностей IS-элементов, например, IS-986 или IS-6110, т.к. данные мигрирующие элементы характерны только для видов микобактерий туберкулеза и присутствуют в геноме микобактерий в числе нескольких копий.

праймеры, фланкирующие фрагмент размером 245 н.п. (нуклеотидных пар) мигрирующего элемента

IS-986, содержащегося в геноме M. tuberculosis в числе 2 – 8 копий.
 
Последовательность праймеров:
INS1 5' - CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC - 3'
INS2 5' - GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA - 3'

геле

обладает наиболее высокими показателями чувствительности и специфичности (для Ампли-Сенс ПЦР-систем

– 1000 микроор-мов/1 мл);

возможность использования разнообразного клинического материала;

возможность одновременного выявления нескольких микроорганизмов в одной биологической пробе, в отличие от бактериологических методов, где для разных возбудителей используются разные способы культивирования;

возбудителя в живом виде;

скорость проведения анализа (иногда

24 ч.);

точное определение этиологии инфекции;

определение количества возбудителя, это особенно актуально для условно-патогенных микроорганизмов, которые вызывают патологию только при определенных условиях;

проведение контроля за течением инфекционного процесса.

С другой стороны, метод ПЦР, как и любой другой тест молекулярной диагностики, во многом зависит от правильности забора и транспортировки исследуемого материала.