Слайд 2
Технология ферментационных процессов.
Иммобилизованный ферменты. Иммобилизованные клетки в биотехнологии.
Лекция №
Слайд 3Под иммобилизацией понимают такую процедуру, в результате которой молекула фермента
тем или иным способом прикрепляется к определенным объектам (носителей), нерастворимых
в воде. Эти объекты вместе с ферментом легко отделяются от раствора после завершения реакции. Химическое «пришивание» фермента к носителю закрепляет конформацию фермента, и является причиной повышения устойчивости и снижения лабильности.
Слайд 4Первым иммобилизованным ферментом, примененным в промышленном масштабе, была аминоацилаза. Она
была использована в Японии в 1969 г. для производства аминокислот,
добавляемых в корм животных. На мировом рынке эта продукция пользуется большим спросом.
Слайд 5Преимущества использования иммобилизованных ферментов:
1. Чистые препараты ферментов неустойчивы при длительном
хранении.
2. Многократное использование ферментов затруднено в промышленных условиях, т.к. их
сложно отделить от реагентов.
Слайд 6Иммобилизованный (гетерогенный) катализатор легко отделить от реакционной среды. Это обусловливает:
1)
возможность остановки реакции в любой нужный момент:
2) повторное использование катализатора;
3)
получение конечного продукта, не загрязнённого ферментом.
Слайд 7Иммобилизация фермента даёт возможность регулировать их каталитическую активность за счёт
изменения свойств носителя.
Иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду,
в которой для него доступной оказывается лишь ограниченная часть общего объёма.
Слайд 8Все существующие методы физической иммобилизации (т.е. иммобилизации, при которой фермент
не соединяется с носителем ковалентными связями, могут быть подразделены на
четыре группы:
Слайд 91) адсорбция на поверхности нерастворимого носителя;
2) включение в поры геля;
3)
пространственное разделение фермента от остальной части с помощью полупроницаемой мембраны;
4)
введение фермента в двухфазную реакционную среду, в которой он растворим, но может находиться только в одной из фаз.
Слайд 11Основные требования, которым должны соответствовать носители:
- Высокая химическая и биологическая
стойкость;
- Высокая механическая прочность;
- Достаточная проницаемость для фермента и субстратов;
-
Высокая пористость;
- Возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран, труб, листов и т.д.);
Слайд 12- Легкое перевода в реакционно-способную форму (активация):
- Высокая гидрофильность, которая
обеспечивает возможность проведения реакции связывания фермента с носителем в водной
среде;
- Невысокая стоимость.
Слайд 13В зависимости от природы носители делятся на:
1. Органические материалы;
2. Неорганические
материалы.
Органические полимерные носители можно разделить на 2 класса:
а) природные;
б) синтетические.
В свою очередь, каждый из классов органических полимерных носителей подразделяется на группы в зависимости от их строения. Среди природных полимеров выделяют: белковые; полисахаридные; липидные носители, а среди синтетических: полиметиленовые; полиамидные; полиэфирные носители.
Слайд 14
К преимуществам природных носителей следует отнести:
Доступность;
2. Полифункциональность;
3. Гидрофильность,
а
к недостаткам – высокую стоимость.
Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто
используют: целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для придания химической устойчивости их линейные цепи поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сетчатые структуры легко вводят различные ионогенные группировки.
Слайд 15Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин,
который в значительных количествах накапливается в виде отходов в процессе
промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру.
Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие как: кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена – желатин.
Слайд 16Синтетические полимерные носители включают полимеры на основе стирола, акриловой кислоты,
поливинилового спирта, полиамидные и полиуретановые поли меры.
Их преимущество:
1.
Механическая прочность;
2. Возможность варьирования в широких пределах величины пор и введения различных функциональных групп.
Синтетические полимеры воспроизведены в таких изделиях, как трубы, волокна, гранулы. Все эти свойства полезны для разных способов иммобилизации ферментов.
Слайд 17Носители неорганической природы представляют собой материалы изготовленные из стекла, глины,
керамики, графитовой сажи, а также оксиды металлов. Их можно подвергать
химической модификации, для чего носители покрывают плёнкой оксидов алюминия, титана, циркония. Или обрабатывают органическими полимерами.
Преимущество неорганических носителей:
лёгкость регенерации.
Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.
Слайд 18При адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за
счёт электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей.
Слайд 19Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется пористостью носителя. Процесс
адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается
при контакте водного раствора фермента с носителем при перемешивании. С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях.
Слайд 20Иммобилизация ферментов путём включения в гель.
Способ иммобилизации ферментов путём
включения в трёхмерную структуру полимерного геля широко распространён благодаря своей
простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но даже отдельных клеток. иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами:
Слайд 211. Фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят
полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с
включёнными в его ячейки молекулами фермента.
2. Фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние.
Для первого варианта используют гели: полиакриламида, поливинилового спирта, силикагеля. Для второго: гели крахмала, агар-агара, агарозы, фосфата кальция.
Слайд 22Метод инкапсулирования разработан в 1974 г. и состоит в том,
что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой
образованы полупроницаемым полимером. Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонсистенции двух соединений, одно из которых растворено с водой, а другое – в органической фазе.
Размер получаемых капсул составляет сотни микрометров, а толщина мембраны - сотые доли микрометра.
Слайд 23Метод включения водных растворов ферментов в липосомы
Впервые данный метод был
применён для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в
1970 году. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель.
Слайд 24Оставшуюся тонкую плёнку липидов выдерживают в водном растворе, содержащем фермент.
В процессе выдержки происходит самосборка липидных структур липосомы, содержащих данный
раствор фермента.
Ферменты, иммобилизованные путём включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и биотехнологических целях.
Слайд 25Химические методы иммобилизации ферментов.
Представляют иммобилизацию ферментов путём образования новых
ковалентных связей между ферментом и носителем – наиболее массовый способ
получения промышленных биокатализаторов.
В отличие от физических вариантов, эти методы иммобилизации обеспечивают прочную и необратимую связь фермента с носителем и сопровождаются стабилизацией молекулы энзима.