БИОТЕХНОЛОГИЯ

А.И. Герцена

Направление 020400 Биология
Профиль Общая биология






Профессор кафедры Зоологии д.б.н., проф. Цымбаленко Надежда Васильевна

биотехнологии, - подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине.
Наиболее

важные свойства систем экспрессии:
1. Тип промотора и терминатора транскрипции;
2. Прочность связывания мРНК с рибосомой;
3. Число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки);
4. Конечная локализация синтезируемого продукта;
5. Эффективность трансляции в организме хозяина;
6. Стабильность продукта в хозяйской клетке.
Никакой универсальной стратегии оптимизации
экспрессии клонированных генов не существует.

отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК:
генетические, молекулярно-биологические, биохимические и

физиологические свойства этого микроорганизма детально изучены
это наиболее дешевый и быстрый способ получения многих белков

используются регулируемые промоторы
lac- и trp- оперонов E.coli
специально сконструированный tac-промотор, включающий

-10- область lac-промотора и -35-область trp-промотора
левый или, pL, промотор бактериофага λ
промотор гена 10 бактериофага Т7


С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов.

Функциональные

модули вектора для
экспрессии в прокариотах

Интеграция

чужеродной ДНК
в хромосому хозяина
Включение плазмидной ДНК в хромосомную ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты плазмидных генов.
Процесс интеграции состоит в следующем:

1. Идентификация подходящего сайта интеграции, т.е. сегмента хозяйской ДНК, последовательность которого может быть прервана без ущерба для функционирования клетки.

2. Выделение и клонирование всего хромосомного сайта интеграции или его части.

3.

Встраивание нужного гена вместе с регулируемым промотором в клонированный сайт интеграции или вблизи него.

4. Перенос полученной генетической конструкции “хромосомный сайт интеграции/клонированный ген” в хозяйскую клетку в составе плазмиды, не способной к автономной репликации в клетках этого хозяина.

5. Отбор и сохранение тех хозяйских клеток, которые экспрессируют клонированный ген. Наследование клонированного гена возможно только в случае его интеграции в хромосому клеток хозяина.

.

от деградации в хозяйских клетках – ковалентное присоединение продукта клонированного

гена к какому-либо стабильному белку хозяина. Подобная конструкция получила название “химерный белок”.
Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соответствующих генов.

Рамка считывания!!!

В зависимости от предназначения белкового продукта клонированного гена он может использоваться как таковой или в составе химерного белка, что встречается нечасто.

бактериального вектора

уровне ДНК программируют введение сайтов узнавания для протеаз. Олигонуклеотидные линкеры,

несущие такие сайты, можно пришить к клонированному гену до того, как такая конструкция будет введена в экспрессирующую векторную систему слияния. Линкером может служить, например, олигопептид Ile-Glu-Gly-Arg, узнаваемый фактором крови Ха, который является специфической протеинкиназой.

к нему сегментом ДНК, кодирующим маркерный пептид Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp –Lys (он

продается под названием Flag), выполняет двоякую функцию: обеспечивает стабилизацию продукта гена интерлейкина-2 и облегчает его очистку.

Интерлейкин-2 - это биологический фактор, стимулирующий
рост Т-клеток и синтез В-клеточных антител.
Химерный белок, образующийся после экспрессии этой
конструкции в дрожжевых клетках, может быть очищен за
один прием с помощью иммуноаффинной хроматографии.

для контроля за уровнем экспрессии вводимого гена и для определения

места локализации его продукта в клетке-хозяине.
В этом случае последовательности гена-мишени сливают с генами, которые кодируют нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано. Они получили название – репортерные гены.

флюоресцентного белка (GFP), люциферазы (LUC), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) и др.
GFP

(green fluorescent protein - зеленый флюоресцентный белок, или белок зеленой флюоресценции) был обнаружен Shimomura с соавт. в 1962 г. у люминесцирующей медузы Aequorea victoria. В 2008 г. Нобелевская премия по химии была присуждена группе ученых из США: Osamu Shimomura, Martin Chalfie и Roger Tsien за "открытие и исследование зеленого флюоресцирующего белка", который стал одним из важнейших исследовательских инструментов в биологии, так как позволяет вести наблюдения за процессами в живых клетках

зеленого (А) и красного (Б) флюоресцирующих белков






Фотографии сделаны на лазерном

сканирующем конфокальном микроскопе “Leica SP2” (увеличение в 400 раз).

клонированными генами, и простота процедуры очистки зависят от их клеточной

локализации.
Транспорт белков через клеточную мембрану обеспечивают N-концевые аминокислотные последовательности – сигнальные пептиды. Иногда удается сделать белок секретируемым, присоединив к кодирующему его гену нуклеотидную последовательность, ответственную за синтез сигнального пептида.

копий и/или размера плазмид и связанное с этим увеличение количества

энергии. Необходимого для их репликации и сохранения.
Недостаток растворенного кислорода в среде и невозможность обеспечения им и всех метаболических реакций, и процесса экспрессии плазмидных генов.
Гиперпродукция чужеродных белков, приводящая к истощению пула компонентов процесса трансляции.
Перегрузка системы экспорта и нарушение правильной локализации жизненно важных белков хозяйской клетки.
Непосредственное влияние чужеродных белков на функционирование хозяйской. И др.

помощью эукариотических систем

эукариотических белков в системе прокариот:
в некоторых случаях нестабильность

или биологическая неактивность
несмотря на тщательную очистку всегда есть вероятность загрязнения пирогенами
Для получения рекомбинантных белков, предназначенных для использования в медицине, были разработаны эукариотические системы экспрессии.

связей Неправильно уложенный белок может оказаться нестабильным и неактивным.
Протеолитическое расщепление

предшественника, удаление определенного участка полипептидной цепи с образованием функционального белка.
Гликозилирование: основная модификация, благодаря которой белки приобретают стабильность, или особые свойства.
Модификация аминокислот в составе белка: фосфорилирование, ацетилирование и др.
Выбранная эукариотическая система экспрессии проверяется на наличие необходимой системы пострансляционной модификации.

их прокариотические аналоги и должны содержать:
эукариотический селективный маркер
эукариотический промотор
соответствующие эукариотические

сайты терминации транскрипции и трансляции
сигнал полиаденилирования мРНК
Большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные.
Челночные векторы несут два типа сайтов инициации репликации, трансляции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционирует в E.coli, а другие – в эукариотических хозяйских клетках.

трансформацией. Для обозначения наследственных изменений в животных клетках после введения

в них экзогенной ДНК был выбран термин трансфекция.

Способы трансформации дрожжевых клеток:
Экзогенную ДНК добавляют к клеткам дрожжей, клеточные стенки которых удалены химически или энзиматически (протопласты).
Клетки перед добавлением чужеродной ДНК обрабатывают ацетатом лития.
Электропорация.

использования клеток дрожжей для экспрессии клонированных генов эукариот:
1. Это одноклеточный

организм, генетика и физиология которого хорошо изучены, и который можно выращивать как в небольших колбах, так и в промышленных реакторах.
2. Выделены и охарактеризованы несколько сильных промоторов этих организмов, а для систем эндогенных дрожжевых экспрессирующих векторов могут использоваться природные (2-микронные плазмиды).
3. В клетках S.cerevisiae осуществляется большое число посттрансляционных модификаций.
4. Лишь очень немногие из собственных дрожжевых белков секретируются в среду; таким образом, если гетерологичный белок секретируется клеткой , то его очистка не составит большого труда.
5. Поскольку дрожжи уже многие годы используют в хлебопечении и пивоварении, то S.cerevisiae включили в список “организмов, признанных безопасными”

в качестве вакцин и фармацевтических препаратов, а также для диагностики:
Вакцины

(поверхностный антиген вируса гепатита В;белок малярийного плазмодия; белок оболочки HIV-1).
Диагностика (белок вируса гепатита С; антигены HIV-1).
Лекарственные вещества ( фактор роста эпидермиса; инсулин; инсулиноподобный фактор роста; тромбоцитарный фактор роста; проинсулин; фактор роста фибробластов; колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов; α-1-антитрипсин; фактор XIIIа системы свертывания крови.

Векторы для S.cerevisiae
Эписомные, или плазмидные векторы широко используются для получения

как секретируемых, так и несекретируемых гетерологичных белков. Однако такие системы экспрессии зачастую оказываются нестабильными при выращивании в больших (больше 10 литров) объемах.
Интегрирующие векторы. Эта стратегия не получила широкого развития из-за малой копийности клонируемого гена (одна копия на хромосому) – малый выход конечного белка.
Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC). Эта система предназначена для клонирования больших фрагментов ДНК (100 т.п.н.), которые потом поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. YAC-система очень стабильна.

которая имеет все необходимое для репликации в дрожжах: теломеры, несколько

сайтов инициации репликации (репликонов),
дрожжевую центромеру , содержит селективный маркер для идентификации и поддержания популяции рекомбинантных клеток. Клонирующий лимит – 100–1 000 тпн.









Бактериальные и дрожжевые искусственные хромосомы применяют для создания геномных библиотек.

ген E.coli – Amp
2. Сайт инициации репликации, функционирующий в E.coli.

– ori .
3. Сегмент дрожжевой ДНК, включающий участки
URA3 ( один из генов биосинтеза урацила)
CEN (последовательность, выполняющая центромерную функцию)
TRP1 (один из генов биосинтеза триптофана)
ARS (дрожжевая автономно реплицирующая последовательность, эквивалентная дрожжевому сайту инициации репликации).
4. Т - теломерные области дрожжевой хромосомы, обеспечивающие стабильность хромосомы.
5. Sma1 – сайт клонирования.

Экспрессирующие векторы для работы с клетками млекопитающих (ЭВМ)

Внехромосомные

ЭВМ используются для изучения функций и регуляции генов млекопитающих. Кроме того, с их помощью могут быть получены аутентичные рекомбинантные белки, которые потенциально могут использоваться в медицинских целях для лечения некоторых заболеваний человека.
Сконструировано большое количество таких векторов, но все они обладают сходными свойствами и похожи на другие эукариотические векторы.

Обобщенная схема

ЭВМ
Полилинкер (ПЛ) и селективный маркер) (СМ) находятся под контролем эукариотического промотора (р) и сигнала полиаденилирования или терминации (ра). Обычно используют регуляторные последовательности ДНК вирусов животных (например, цитомегаловируса человека, SV40 или HSV) или генов млекопитающих (гена β-актина, металлотионеина, тимидинкиназы или гена гормона роста). Репликация в клетках E.coli и в клетках млекопитающих обеспечивается сайтами инициации репликации ori и ori соответственно. Для отбора трансформированных клеток E.coli используется ген устойчивости к амрициллину Amp.

экспрессии

кодирующий неомицинфосфотрансферазу, которая обеспечивает устойчивость трансфецированных клеток к токсичному соединению

генетицин (G-418)
2.Ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (DGFR). В этой системе используют клетки с дефектом гена DGFR, которые не способны расти на среде с метотрексатом. Отобранные клетки пересевают на среды с большей концентрацией метотрексата, отбирая таким образом клетки, содержащие больше копий вектора.
3.Ген фермента глутаминсинтетазы (GS), обеспечивающий устойчивость к цитотоксическому действию метионинсульфоксимина.

Для создания белков со специфическими свойствами можно использовать подход, основанный

на внесении изменений в кодирующие их клонированные гены. Это позволяет получать белки с другими, чем у их аналогов свойствами.
Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом. (Michael Smith, Нобелевская премия – 1993).

Два подхода сайт-направленного мутагенеза

белка с известной первичной структурой