Экспериментальные методы исследований

света  любое отклонение света от первоначального направления; иными словами,

преобразование света веществом, сопровождающееся изменением направления его распространения, а иногда, и частоты. Светорассеяние из-за удлинения оптического пути луча света через исследуемую среду сопровождается ослаблением мощности оптического излучения, уменьшением проходящего потока.

и поглощение света.
Данные явления можно описать с помощью двух чисел

– показателя поглощения и рассеяния, одной функции – индикатрисы рассеяния (зависимость интенсивности рассеянного системой света от угла регистрации); а чтобы учесть изменение состояния поляризации при рассеянии, необходимо ввести матрицы рассеяния. Такие характеристики носят название первичных оптических.

на молекулярном уровне, либо на уровне скопления молекул, либо на

уровне частиц. Физическая природа рассеяния одинакова для всех систем, она не зависит от типа неоднородности.

в условно однородных средах, а именно: чистые газы, жидкости, твердые

тела – можно выделить отдельные неоднородности (атомы, молекулы). Поэтому все среды рассеивают свет.
Принято считать среду однородной, когда масштаб атомной или молекулярной неоднородности среды мал по сравнению с длиной волны падающего света.

области. Приложенное поле падающей электромагнитной волны наводит в каждой области

дипольный момент. Эти диполи колеблются с частотой приложенного поля и поэтому создают вторичное излучение во всех направлениях. Полное рассеянное поле в направлении удаленной точки Р получается сложением рассеянных волн с учетом фазовых соотношений между ними.

упругим или рэлеевским (в честь английского физика Дж.А. Рэлея, который

впервые описал и изучил его природу). Более корректное определение рэлеевского рассеяния – рассеяние на частицах много меньших, чем длина волны падающего света.
Рассеяние света может происходить на электронах среды или свободных электронах (Комптона явление, Комптона обратный эффект), на молекулах рассеивающей среды и на оптических неоднородностях, возникающих за счет флуктуаций, на частицах – рассеяние Тиндаля (для частиц, размеры которых составляют доли длины волны) и рассеяние Ми (для частиц, размер которых составляет несколько длин волн), на адиабатических флуктуациях плотности (Мандельштама  Бриллюэна рассеяние).

света представляют собой комбинацию (суммы или разности) частот колебаний падающего

света с частотами собственных колебаний молекул рассеивающего вещества. Отсюда данное явление получило название комбинационного рассеяния (КР) или эффекта Рамана.
При комбинационном рассеянии монохроматического света с частотой в спектре рассеянного света имеются дополнительные частоты  , где – постоянные, характеризующие рассеивающее вещество и
не зависящие от частоты рассеиваемого света. Величины представляют собой собственные частоты колебаний молекул рассеивающего вещества, соответствующие ИК-области спектра. Спектры комбинационного рассеяния света каждого соединения настолько специфичны, что могут служить для надежного анализа состава смесей, например смесей углеводородов.

определяется как характеристиками падающего светового потока (его интенсивностью, частотой или

длиной волны, углом падения на объект), так и свойствами рассеивающей среды: размерами частиц, их формой и количеством, способностью поляризоваться и др.

и сводится к закону Рэлея, который гласит интенсивность рассеяния радиации

зависит от обратной четвертой степени длины волны. Смысл закона в том, что более короткая часть спектра проходя через атмосферу земли рассеивается сильнее (сине-голубая).
 
    

в микрообъемах, т.е. возникающих в результате теплового движения случайных увеличений

на весьма малое время числа молекул в том или ином микрообъеме системы. Микрообъемы, в которых осуществляются флуктуации плотности, должны быть значительно меньше куба длины световой волны.
Рассеяние света растворами обусловлено флуктуациями концентрации вещества в объемах того же порядка.
В дисперсиях рассеяние света зависит от размера частиц, их распределения по размерам. С возрастанием числа и размеров частиц, с увеличением коэффициента преломления, зависящего от поляризуемости, увеличивается интенсивность рассеянного света.

результатах точной теории Ми рассеяния света на частицах шарообразной формы

произвольного размера при отсутствии в системах вторичного и многократного рассеяния.
Метод спектротурбидиметрии (СТ) включает ряд построений, позволяющих определять средние размеры и оценивать распределения по размерам; определять показатель преломления, объемную, числовую и весовую концентрацию в широком диапазоне изменения температуры, общей концентрации сухих веществ в системе и др. при минимальном количестве исходных данных, требуемых в дополнение к измерениям спектра мутности, которые производятся на широко распространенных приборах типа СФ.

– длина кюветы. Мутность численно равна обратной длине свободного

пробега светового кванта в дисперсии. Размерность мутности [ ]=cм1;  , где – волновой экспонент. – оптическая плотность, измеряемая на спектрофотометрах,
связана с мутностью соотношением

для дисперсий рассеивающих частиц вне полосы поглощения.

n от  или  из таблиц определяют средний эффективный

радиус (диаметр d) частиц в дисперсии при известном m. Для анизодиаметрических частиц этот радиус имеет смысл радиуса шара, объем которого эквивалентен объему несферической частицы. Если размер частиц известен или определен независимым путем (например микроскопически), то можно определить величину относительного показателя преломления. С помощью соответствующих таблиц можно рассчитать численную концентрацию частиц по формуле
 
,

к направлению падающего пучка – , существенно

зависит от . Кривая, описывающая эту зависимость в плоскости, в которой лежат направление падающего пучка и направление наблюдения рассеянного света, называется индикатрисой рассеяния.
в основном определяется:
а) Под малыми углами – дифракцией, т.е. размерами частиц;
б) При больших значительными оказываются процессы преломления и отражения, зависящие от внутренней неоднородности частицы и от состояния ее поверхности.

и , где – радиус частиц, – длина волны света в
вакууме. Физический смысл параметра – это сдвиг фазы световой волны при прохождении через шар вдоль его диаметра, – это относительный размер частиц по сравнению с длиной волны падающего света.
Для маленьких биологических частиц ( –мало, интенсивность рассеяния пропорциональна (т.е. , где – объем) (рэлеевское рассеяние) и симметрична относительно направления падающего пучка. Внутренняя структура не влияет на параметры рассеяния ( ~ произвольно).

λ, то индикатриса становится более вытянутой, и большая часть интенсивности

рассеянного света сосредотачивается в передней полусфере по направлению падения света, т.е. волна в боковые направления и направление назад гасятся в результате взаимной интерференции (эффект Ми).
Например, при .

углами
Интенсивность света обычно измеряют на нефелометрах, например, при углах регистрации

20º, 45º, 90º и 135º , можно регистрировать на флуоресцентных спектрофотометрах.
В     последнее   время    за    рубежом   и   у    нас   в   стране интенсивно разрабатываются проточные цитометры – приборы, в которых регистрация светорассеяния от отдельных клеток в потоке осуществляется одним или несколькими детекторами, расположенными под разными углами. Кроме того были созданы детекторы особой конструкции, позволяющие одновременно регистрировать сигналы светорассеяния при большом наборе углов, например, при 32 углах в интервале 0-30º

(интенсивность флуоресценции при одной или нескольких длинах волн, объема Коултера)

и сортировкой клеток . В отличие от измерения интенсивности рассеяния в суспензии, где эти значения усредняются, в проточных системах получается распределение клеток по интенсивности. Однако следует отметить, что в потоке клетки могут ориентироваться, что влияет на сигнал рассеяния.

успешных методов определения размеров можно считать метод отношения интенсивностей, который

был теоретически разработан Ходкинсоном. Показано, что
линейно зависит от размера частиц и не зависит от их показателя преломления; в теоретической работе Латимера показано, что для клеток диаметром 0,5-2,5 мкм отношение интенсивностей
не зависит от гетерогенности суспензии.

также можно использовать для определения размера частиц. Так, для больших

частиц, индикатриса которых значительно вытянута вперед за счет преобладания вклада дифрагированного света, теория дает положение 1-го минимума

влиять на интенсивность рассеяния.









Зависимость относительной интенсивности светорассеяния от:

1, 2 –теоретические зависимости для эквивалентной гомогенной сферы (1) и покрытой сферы (2); 3, 4 – экспериментальные зависимости для яйцеклеток китайского хомячка в митозе (3) и в стадии G1(4)

например, показано, что при заражении клеток вирусом интенсивность светорассеяния под

углом 20° увеличивается в 2,3 раза, в то время как под углами 2,5°  4° практически не изменяется



Зависимость интенсивности
рассеяния от угла для клеток РК-115,
выращенных в культуре :
1 – нормальные
клетки,
2 – клетки,
зараженные вирусом
свиной холеры

интенсивность рассеяния при больших углах. Пользуясь соотношением

,  можно  оценить   вклад   внутренних  структур  в зависимости от их размеров. Так дифракция на 1,5 мкм лизосомах будет сказываться до , а на самих клетках – r ~ 10 мкм – до

) для исследования внутренней структуры клеток, толщины и показателя преломления клеточной мембраны . Например, расчет показывает, что увеличение толщины мембраны от 50 до 100 может привести к увеличению сигнала обратного рассеяния ~ на 70 %

отражает особенности соответствующих структур клетки. dкл, dя – диаметры клетки

и ядра; t – толщина клеточной мембраны; mкл и mt – относительные показатели
преломления клетки и клеточной мембраны

размерами всей клетки и ядра, положением ядра, клеточными включения и

т.д., то есть особенностями структуры клеток данной популяции, поэтому на основании вида индикатрис той или мной клеточной популяции можно разработать методы анализа клеток, предсказать, в каком интервале углов разделение по интенсивности светорассеяния будет более удовлетворительным. Эта задача особенно важна в клинической практике, например, при определении доли опухолевых клеток. Популяция, казавшаяся гомогенной при исследовании под одним углом, может оказаться гетерогенной при исследовании под разными углами.

или ее приближениям, существует вторая группа работ, в которых просто

сравниваются световые потоки, рассеянные от контрольных образцов и образцов, подвергнутых различным воздействиям.

связано с изменением следующих величин: концентрации, размеров, формы, показателя преломления

клеток, морфологии (размер ядра, митохондрий, появление включений и т.д.), гетерогенности суспензии по всем параметрам. При воздействии одна, несколько или многие из этих характеристик могут меняться незначительно, но в сумме это может вызвать значительное изменение рассеянного потока.