ЕНДОГЕННА РЕГУЛЯЦІЯ КЛІТИННОГО ЦИКЛУ 1.Дослідження L. Hartwell із США в

1970-1971 рр. - клітини пекарських дріжджів. Він ввів поняття «контрольна

точка» - чекпоінт (checkpoint), які розташовані в кінцях G1, G2 і М фаз.
2. PM Nurse продовжив розпочаті дослідження клітинного циклу, використовуючи клітини дріжджів іншого типу -в середині 70-х рр.. відкрив в клітинах цих дріжджів ген сдс2, який грає ключову функцію в регуляції переходу від G2 до М.
У 1987 р. він виділив такий же ген у людини - СDK1, його продукт білок - циклін -залежна протеїнкіназа, активність якого залежить від зворотного фосфорилювання.
За відкриття циклінів та циклін-залежних кіназ в 2001 р Leland H. Hartwell, R. Timothy Hunt і Paul M. Nurse отримали Нобелівську Премію в галузі Медицини і Фізіології

результати досліджень трьох груп експериментів:
- експерименти, які стосуються злиття клітин
-

вивчення поділу бластомерів
- дослідження мутантів (це в основному стосується клітин-дріждів).

знаходились в двух різних фазах – наприклад G1 та S-періодах.

Утворені химерні клітини містили по два ядра, в одному із них на момент злиття відбувався синтез ДНК (S-період) в іншому (G1) –ні. В утвореній химерній клітині відбувається синтез ДНК.
Відповідно - в S-клітині містяться фактори, здатні дифундувать в ядра G1 –клітин і можуть ініціювать реплікацію ДНК.

амфібій та морських їжаків, а також утворені із них зародки

на ранніх стадіях розвитку. Як відомо, на цих стадіях інтенсивно відбувається мітотичний поділ – всі клітини при цьому діляться одночасно. Все це дозволяє використовувати цей біологічний матеріал для отримання біохімічних білкових факторів, відповідальних за мітоз. Після очистки відповідних субстанцій їх вводять в фракцію ооцитів, які знаходяться в самому початку мейозу. Якщо в отриманому зразку містяться фактори, що запускають поділ, ооцити із стану спокою вступають в мейотичний поділ і перетворюються в яйцеклітину

експериментах використовують дріжджі, в вегетативній фазі життєдіяльності їх клітини гаплоїдні

(містять по одній копії генів), що полегшує виявлення мутацій, які можна індукувати різними способами: опроміненням, нагріванням, хімічними агентами.
Подібні мутації порушують клітинний цикл, при якому змінююються розміри клітин.
А)при мутаціях cdc (cell-division-cycle цикл поділу клітин) мутаціях йде блокування поділу клітин, що призводить до їх постійного росту без почкування – формуються гігантські клітини
Б). крихітні мутації wee-поділ відбувається до того, як клітина встигла достатньо подовжитись – в результаті утворюються клітини дуже малої довжини.
В обох випадках ушкоджуються різні гени, для ідентифікації яких поступають наступним чином:
-виділяють ДНК із нормальних клітин
-фрагментують її за допомогою рестриктаз
-включають отримані фрагменти нормальної ДНК в склад різних плазмід
-вводять плазміди із досліджуваним фрагментом в мутантні клітини
Якщо мутація рецесивна, а введений фрагмент ДНК містить “правильну” версію мутованого гену, то клітинний цикл нормалізується і утворюється колонія клітин звичайного розміру. Таким чином можно досліджувати роль кожного із генів в регуляції клітинного циклу.

циклін - Cdk
Cyclins and cyclin-dependent kinases (CDKs), це два

класи молекул, необхідних для регуляції клітинного циклу. Цикліни формують регуляторну субчастину, а кінази — каталітичну субчастину активованого гетеродимеру.

фаз клітинного циклу відіграють циклін-залежні кінази. Кожна із них фосфорилює

певні білки, які залучені в відповідну фазу клітинного циклу, що призводить до її активації або інгібування.

білки різних фаз клітинного циклу і таким чином активують або

інгібують їх.
Cdk функціонує в комплексі з цикліном, який не лише активує кіназу, а й визначає її субстратну специфічність.
Циклін-Cdk – гетеродимерний комплекс, в якому циклін відіграє роль регуляторної (активаторної) субодиниці, а Cdk – каталітичної.

окрім інших різноманітних впливів, запускають транскрипцію гену Cdk1.
Зв’язування активаторної субодиниці

– цикліну.
Зв’язування інгібіторної субодиниці. Інгібіторами Cdk є білки двох родин – INK4 (p15, p16) та КІР1 (р21, р27, р57), які перешкоджають активації Cdks.
Фосфорилювання/дефосфорилювання Cdks специфічними кіназами/фосфатазами, що призводить до їх активації чи інгібування.

мішенню дії мітогенних факторів часто є ген цикліну D.
Розпад циклінів:

убіквітинзалежний протеоліз.
Циклін В–Cdk1 (MPF) фосфорилює певні білки і стимулює вхід клітини в мітоз, але для завершення мітозу рівень MPF має зменшитись. Це забезпечується наступним чином: під час метафази мітозу MPF фосфорилює, окрім інших білків, фактор APC (anaphase-promoting complex) – убіквітинлігазу, специфічну до MPF. АРС швидко приєднує молекули убіквітину до цикліну В, який після цього швидко руйнується в протеосомі.
Синтез інгібіторів Cdks: в деяких регуляторних шляхах білки родини Smad стимулюють синтез р15, р21 та інших інгібіторів, в результаті чого поділи припиняються.

Cdk6.
Зниження вмісту інгібіторів Cdks.
Дефосфорилювання і підвищення активності Cdk4, Cdk6, а

також Cdk2.

Все це забезпечує накопичення в клітині активних комплексів циклін D–Cdk4,6. Вони починають готувати клітину до поділу.

МАРК, в результаті чого в клітині знижується кількість активних комплексів

циклін D–Cdk4,6 і поділи припиняються. Водночас через інші сигнальні шляхи TNFα ініціює апоптоз.
TGFβ-рецептор фосфорилює і активує Smad2 та Smad3, після чого вони приєднують Smad4 і дифундують в ядро, щоб активувати експресію генів інгібіторів Cdks (p15, p21). Накопичення цих інгібіторів призводить до зупинки проліферації.

позаклітинного матриксу (базальної мембрани, колагенових волокон, поверхні флакона тощо).
Інформація про

такий зв’язок надходить від інтегринів через тирозинкінази FAK та Src. Субстратом Src є адапторний білок SHC, який передає сигнал на каскад МАРК паралельно з сигналом від рецепторів факторів росту.

Тобто для вступу в мітотичний цикл необхідні як сигнал про прикріплення до субстрату, так і мітогенна стимуляція, причому в неприкріпленій клітині активація мітозу блокується.

міжклітинний контакт надходить від адгезивних білків кадгеринів. При взаємодії з

іншою клітиною кадгерин набуває здатності зв’язувати білок β-катенін. У вільній формі β-катенін утворює активний комплекс із транскрипційним фактором Tcf4, який мігрує в ядро і в кінцевому результаті стимулює експресію генів цикліну D та білка Мус (останній активує експресію фосфатази, яка дефосфорилює і активує Cdk4).
При міжклітинній взаємодії β-катенін зв’язується з кадгерином, і поділи припиняються.

утворення певного комплексу транскрипційних факторів, що активують експресію генів ранньої

відповіді.
Цей комплекс містить β-катенін та фактор Tcf4 (коли немає міжклітинних контактів), а також фактори, що активуються через каскад МАРК (його повноцінне функціонування можливе при дії ростового фактора та за умови прикріплення клітини до матриксу).
Отже, для вступу в мітотичний цикл необхідне виконання трьох умов:
відсутність міжклітинних контактів
прикріплення клітини до субстрату
позаклітинний стимул (ростовий фактор)

попередньої стадії
стимуляцію подій поточної стадії
утворення або активацію комплексів наступної стадії

Тобто

діє своєрідний ланцюговий механізм, в якому кожна стадія процесу готує умови для наступної стадії, причому після проходу точки рестрикції процес іде незалежно від зовнішніх стимулів.

та подібні до нього білки р105 та р130.
Білок pRb

в нефосфорильованому стані інгібує транскрипційні фактори E2F i DP. Після фосфорилювання pRb дисоціює, а комплекс E2F-DP активується і набуває здатності стимулювати експресію цілого ряду генів, серед них:
гени циклінів Е, А та Cdk1,2
гени самих факторів E2F (позитивний зворотний зв’язок, самопідтримання процесу)
гени ключових ферментів синтезу ДНК (підготовка до S-періоду)
гени наступних транскрипційних факторів, що стимулють в кінці G1-періоду синтез цикліну В

– убіквітинлігази, яка стимулює швидкий протеоліз цикліну В. Як наслідок,

рівень цикліну В продовжує зростати до метафази мітозу.
Фосфорилювання та інактивація інгібіторів комплексів циклін A–Cdk2 та циклін В–Cdk2. звільнені від інгібуючого впливу комплекси вводять клітину в S-період.

одноразової реплікацї ДНК
утворення компонентів MPF (mitosis-promoting factor) – цикліну В

та Cdk1
гальмування активності цього комплексу і запобігання передчасному входу клітини в мітоз

MPF фосфорилює гістон Н1 та білки SMS (structural maintanance of

chromosomes) з утворенням компактних метафазних хромосом.
Розпад ядерної оболонки. MPF фосфорилює білки ядерної ламіни, що призводить до їх дисоціації, при цьому ядерна мембрана розпадається на дрібні везикули.
Формування веретена поділу. MPF фосфорилює тубулін з утворенням мікротрубочок веретена.
Затримка передчасної цитотомії. MPF фосфорилює легкі ланцюги міозину, що запобігає їх взаємодії з актином і утворенню кільця до того моменту, поки хромосоми не розійдуться до полюсів клітини.

сприяє швидкому протеолізу ряду білків, в тому числі і MPF)

фосфорилюється і активується MPF в метафазі мітозу.
Маркує до протеолізу білки-інгібітори анафази, що входять до складу центромерних комплексів, які утримують сестринські хроматиди від розходження.
Маркує до протеолізу MPF в пізній анафазі. Після цього фосфатази дефосфорилюють білки, що були фосфорильовані MPF в метафазі. Це призводить до відновлення ядерної оболонки, деконденсації хромосом, утворення актоміозинового кільця і цитотомії.

внутрішньоклітинними факторами незалежно від мітогенних стимулів.
Головними факторами, які регулюють перебіг

клітинного циклу, є цикліни та циклінзалежні кінази, які в комплексі фосфорилюють певні білки-мішені, активуючи або інактивуючи їх.
Завдяки складній системі позитивних та негативних зворотних зв’язків фази мітозу відбуваються строго послідовно, оскільки ефекторні молекули кожної фази створюють умови для переходу до наступної.

кінази та їх роль в регуляції активності циклінів
4Регуляція синтезу та

розпаду активаторів та інгібіторів циклін-залежних кіназ
5Циклін D в регуляції клітин проліферативного пулу нормальних та трансформованих клітин.
6Механізми регуляції активності циклінів на різних фазах клітинного циклу.
7Циклічність активації та інактивації комплексів циклінів-циклінзалежних кіназ.
8Аутокринна регуляція клітинного циклу в нормі та за патологічних станів
9Рецептори з тирозинкіназною активністю в екзогенній регуляції клітинного циклу.
10Яку роль відіграють протеїни двох родин – INK4 (p15, p16) та КІР1 (р21, р27, р57) в регуляції клітинного циклу?
11За яким механізмом відбувається розпад циклінів?
12Яку роль в регуляції клітинного циклу відіграє каскад МАРК?
13 Механізми паракринного впливу на клітинний цикл.