Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования

университет кафедра медицинской биохимии
Введение в биохимию
Биохимия белка
Энзимология I

Доцент медицинской биохимии к.м.н.. Е.И. Паличева

Кемерово 2020

Лекция 1

Введение в медицинскую энзимологию.
Свойства ферментов
строение ферментов

белков входят углерод, водород, азот, кислород, сера. Часть белков образует комплексы

с другими молекулами, содержащими фосфор, железо, цинк и медь.

Белки обладают большой молекулярной массой: яичный альбумин — 36 000, гемоглобин — 152 000, миозин — 500 000. 

полноценными — содержат весь набор аминокислот; 
неполноценными — какие-то аминокислоты в их составе

отсутствуют.

Если белки состоят только из аминокислот, их называют простыми.

Если белки содержат помимо аминокислот еще и неаминокислотный компонент (простетическую группу), их называют сложными.

Простетическая группа может быть представлена металлами (металлопротеины), углеводами (гликопротеины), липидами (липопротеины), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеины).

аминогруппу (–NH2),
радикал или R-группу (остальная часть молекулы).
Строение радикала

у разных видов аминокислот — различное. В зависимости от количества аминогрупп и карбоксильных групп, входящих в состав аминокислот, различают: нейтральные аминокислоты (R - гидрофобные неполярные и полярные незаряженные), имеющие одну карбоксильную группу и одну аминогруппу; основные аминокислоты, имеющие более одной аминогруппы; кислые аминокислоты, имеющие более одной карбоксильной группы (R- полярные заряженные + и -).
Аминокислоты являются амфотерными соединениями, так как в растворе они могут выступать как в роли кислот, так и оснований. В водных растворах аминокислоты существуют в разных ионных формах.

в белках и пептидах

аминокислотного состава белка и природы растворителя. Водорастворимые белки называются альбуминами,

к ним относятся белки крови и молока. К нерастворимым, или склеропротеинам, относятся, например, кератин (белок, из которого состоят волосы, шерсть млекопитающих, перья птиц и т. п.) и фиброин, который входит в состав шёлка и паутины

Ионизация. Заряд белковой молекулы обусловлен реакцией среды и соотношением ионогенных групп в белковой молекуле.

Гидратация. Молекула белка дифильна, в ней имеются гидрофильные и гидрофобные группы, причем гидрофильные в большинстве нативных белков находятся на поверхности, а гидрофобные внутри белковой молекулы.

заряды способствуют растворимости белка, т.к. препятствуют соединению молекул и выпадению

в осадок.

Наличие гидратной оболочки, препятствующей объединению белковых молекул.

Для осаждения белка, его необходимо лишить этих двух факторов устойчивости. Методом осаждения белка является высаливание - осаждение белка с помощью нейтральных солей.

В полунасыщенном растворе (NH4)2-SO4 осаждаются глобулины, а в насыщенном - альбумины.

После удаления осаждающего фактора, белки переходят в растворённое состояние.

при которой суммарный электрический заряд молекул данного белка равен нулю

и, соответственно, они не перемещаются в электрическом поле (например, при электрофорезе).
В изоэлектрической точке гидратация и растворимость белка минимальны.
Величина pI зависит от соотношения кислых и основных аминокислотных остатков в белке: у белков, содержащих много кислых аминокислотных остатков, изоэлектрические точки лежат в кислой области (такие белки называют кислыми), а у белков, содержащих больше основных остатков, — в щелочной (основные белки). Значение pI данного белка также может меняться в зависимости от ионной силы и типа буферного раствора, в котором он находится, так как нейтральные соли влияют на степень ионизации химических группировок белка.

в клетке.
S + Е Р

где
S- субстрат
Е- фермент
Р- продукт

история открытия
Энзим в переводе из греческого означает «закваска».

Открытию этого вещества человечество обязано голландцу Яну Баптисту Ван-Гельмонту, жившему в XVI веке. В свое время он весьма заинтересовался спиртовым брожением и в ходе исследования нашел неизвестное вещество, ускоряющее этот процесс. Голландец назвал его fermentum, что в переводе означает «брожение».
Затем, почти трема веками позже, француз Луи Пастер, также наблюдая за процессами брожения, пришел к выводу, что ферменты – не что иное, как вещества живой клетки.
А через некоторое время немец Эдуард Бухнер добыл фермент из дрожжей и определил, что это вещество не является живым организмом. Он также дал ему свое название – «зимаза».
Еще несколькими годами позже другой немец Вилли Кюне предложил все белковые катализаторы разделить на две группы: ферменты и энзимы. Причем вторым термином он предложил называть «закваску», действия которой распространяются вне живых организмов.
И лишь в 1897 году решено использовать энзим и фермент как абсолютные синонимы.

находят применение в качестве диагностических (энзимодиагностика) и терапевтических (энзимотерапия) средств.

Гний, группа заболеваний связанных генетически обусловленным отсутствием или низкой активностью ферментов – это энзимопатология.
Энзимодиагностика
Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:
· при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;
· количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;
· активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени и отличается от нормальных значений;
· ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);
· существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.
Кроме того, ферменты используют в качестве специфических реактивов для определения ряда веществ. Так, глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови. Фермент уреазу используют для определения содержания количества мочевины в крови и моче. С помощью различных дегидрогеназ обнаруживают соответствующие субстраты, например пируват, лактат, этиловый спирт и др.

активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на

следующих позициях:
при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;
количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;
активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени и отличается от нормальных значений;
ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);
существуют различия во внутриклеточной локализации ряда
ферментов.

реактивов для определения ряда веществ. Так, глюкозооксидазу применяют для количественного

определения глюкозы в моче и крови. Фермент уреазу используют для определения содержания количества мочевины в крови и моче. С помощью различных дегидрогеназ обнаруживают соответствующие субстраты, например пируват, лактат, этиловый спирт и др.

основана на комплексном воздействии на ключевые процессы, происходящие в организме.

(Фестал, Панзинорм форте, Мезим форте, Энзистал, Вобэнзим и т.п.), содержащие

пепсин, трипсин, амилазу и т.п., и используемые для заместительной терапии при нарушениях переваривания веществ в желудочно-кишечном тракте.
Тканевой фермент гиалуронидаза нужна организму для обратимого изменения проницаемости межклеточного вещества, в основе которого находится гиалуроновая кислота. Лекарственную форму гиалуронидазы – лидазу – вводят для размягчения рубцов, появления подвижности в суставах, рассасывания гематом.

применяют при асфиксии новорожденных, астматических состояниях, сердечной недостаточности, различных видах

гепатита и т.п.
Рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза входят в состав глазных капель для лечения вирусных конъюнктивитов. При нанесении на рану они разжижают гной, при ингаляциях уменьшают вязкость слизи, деполимеризуя нуклеиновые кислоты в мокроте.
Трипсин ингалируют при бронхолегочных заболеваниях для разжижения густой и вязкой мокроты.
Коллагеназа, трипсин для ускорения отторжения некротизированных тканей, для очистки трофических язв.

центр ( для аллостерических ферментов)


Активный центр —это особая часть молекулы фермента, определяющая

её специфичность и каталитическую активность.[1]

с теми её частями, которые непосредственно участвуют в реакции. Характер

взаимодействия фермента и субстрата говорит о наличии в активном центре ряда структурных групп, соединяющихся с различными участками субстрата.
В состав активного центра могут входить небелковые простетические группы, молекулы некоторых коферментов, неорганические ионы.
Взаимодействие между активным центром фермента и молекулой субстрата осуществляется при их сближении на расстояние порядка 15—20 ангстрем, с увеличением расстояния оно быстро ослабевает.

субстратом.
Каталитический участок – обеспечивает превращение субстрата в продукт.

различных участков полипептидной цепи или различных полипептидных цепей, пространственно сближенных.

Образуется на уровне третичной структуры белка-фермента.

из белковой
части (АПОФЕРМЕНТА)
в состав сложного фермента ( ХОЛОФЕРМЕНТА)

кроме остатков аминокислот могут входить небелковые простетические группы, молекулы некоторых коферментов, неорганические ионы.

ферментов сводятся к ускорению химических реакций, отличаясь от других катализаторов

уникальными свойствами:
высокой эффективностью действия;
способностью работать в мягких (физиологических) условиях;
специфичностью действия;
зависимость от количества S и E
способностью к регуляции.

фермент выполняет специфическую функцию, связанную с присущей ему глобулярной структурой.

Однако активность многих ферментов зависит от небелковых соединений, называемых кофакторами. Молекулярный комплекс белковой части (апофермента) и кофактора называется холоферментом.
Роль кофактора могут выполнять ионы металлов (Zn2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+, K+, Na+) или сложные органические соединения. Органические кофакторы обычно называют коферментами, некоторые из них являются производными витаминов. Тип связи между ферментом и коферментом может быть различным. Иногда они существуют отдельно и связываются друг с другом во время протекания реакции. В других случаях кофактор и фермент связаны постоянно и иногда прочными ковалентными связями - небелковая часть фермента называется простетической группой.

комплементарности между ферментом и субстратом;
непосредственное участие в реакции в качестве

еще одного субстрата.
выступают как доноры или акцепторы определенных химических групп (в этой роли обычно выступают органические коферменты).

Перенос водорода (электронов)

FAD, FMN
Перенос водорода (электронов)

Кофермент А
Активация и перенос ацильных групп

Биотин
Связывание СО2

Пиридоксальфосфат
Перенос аминогрупп
Тетрагидрофолиевая кислота
ТГФК
Перенос одноуглеродных фрагментов

Витамин РР( В5), никотиновая
кислота

Рибофлавин, В2


Пантотеновая кислота, В3

Биотин, витамин Н

Пиридоксин, витамин В6


ФОЛАТ, Витамин В9

катализируемой реакции
Оксидоредуктазы - Окислительно-восстановительные реакции.
Трансферазы - Перенос отдельных групп атомов

от донорной молекулы к акцепторной молекуле.
Гидролазы - Гидролитическое расщепление связей
(с участием воды).
Лиазы – Расщепление (образование) связей без участия воды
Изомеразы - Взаимопревращение различных изомеров.
Лигазы (синтетазы) - Образование связей в реакции конденсации двух различных соединений (используется энергия АТР).

ферментов. Они подразделяются на шесть классов, каждый класс имеет определенный

номер.
Каждый класс ферментов подразделяется на подклассы, которые в свою очередь подразделяются на подподклассы.
Для каждого фермента определенный шифр, состоящий из четырех кодовых цифр, разделенных точками. Первая цифра обозначает номер класса, вторая – номер подкласса, третья – номер подподкласса, четвертая – порядковый номер фермента в данном подподклассе.
пример: 1.1.1.1. – АДГ -алкогольдегидрогеназа

реакции между ними не беспорядочны, а образуют строго определенные метаболические

пути, характерные для данной клетки. Индивидуальность клетки в большой степени определяется уникальным набором ферментов, который она генетически запрограммирована производить. Отсутствие даже одного фермента или какой-нибудь его дефект могут иметь очень серьезные отрицательные последствия для организма.

(S)
ES – образование комплекса и химическая модификация
EP

(превращение S в Р)

E+P – Высвобождение Е и Р

связывание с лигандом - субстратом (S). Это происходит в области

активного центра, который формируется из нескольких специфических R-групп аминокислот, определенным образом ориентированных в пространстве.

фермента строго соответствует конфигурации субстрата и не изменяется при его

присоединении. Эта модель хорошо объясняет абсолютную специфичность, но не групповую.

взаимодействия.
Ферменты, в основном, — не жесткие, а гибкие молекулы. Активный

центр фермента может изменить конформацию после связывания субстрата. Боковые группы аминокислот активного центра принимают такое положение, которое позволяет ферменту выполнить свою каталитическую функцию.
В некоторых случаях молекула субстрата также меняет конформацию после связывания в активном центре. Модель индуцированного соответствия объясняет не только специфичность ферментов, но и стабилизацию переходного состояния. Эта модель получила название «рука-перчатка».

На основании этого различают обратимое и необратимое ингибирование. По механизму

действия ингибиторы подразделяют на конкурентные и неконкурентные.

химическими веществами (ингибиторами). По характеру действия ингибиторы могут быть обратимыми

и необратимыми. В основе этого деления лежит прочность соединения ингибитора с ферментом. Другой способ деления ингибиторов основывается на характере места их связывания. Одни из них связываются с ферментом в активном центре, а другие - в удаленном от активного центра месте. Они могут связывать и блокировать функциональную группу молекулы фермента, необходимую для проявления его активности. При этом они необратимо, часто ковалентно, связываются с ферментом или фермент - субстратным комплексом и необратимо изменяют нативную конформацию. Это, в частности, объясняет действие Hg2+, Pb2+, соединений мышьяка.
Пример, диизопропилфторфосфат ингибирует ферменты, имеющие серин в активном центре. Таким ферментом является ацетилхолинэстераза, катализирующая следующую реакцию:

проведения нервного импульса (происходит каждый раз, прежде чем второй импульс

будет передан через синапс).

ИНГИБИРОВАНИЯ).
Приводит к утрате способности нейронов проводить нервные импульсы.
Приводит к

утрате способности нейронов проводить нервные импульсы.

Приводит к утрате способности нейронов проводить нервные импульсы.

и противовоспалительного средства объясняется тем, что аспирин ингибирует фермент, катализирующий

синтез простагландинов.
Простагландины - вещества, участвующие в развитии воспаления. Ингибирование обусловлено ковалентной модификацией одной из аминогрупп фермента – циклооксигеназы (простагландинсинтетазы).

Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за связывание с активным центром.

Это происходит потому, что ингибитор и субстрат имеют сходные структуры.

подвергается ферментативному превращению. Более того, образование EI уменьшает число молекул

свободного фермента, и скорость реакции снижается. Связывание S и I происходит взаимоисключающим образом. Образуется либо ES, либо EI, но не EIS.

Так как конкурентный ингибитор обратимо связывается с ферментом, то можно сдвинуть равновесие реакции E + I ↔ EI влево простым увеличением концентрации субстрата.

I

Конкурентное ингибирование

EI

ES

для лечения инфекционных болезней. .
Сульфаниламиды – это структурные аналоги

парааминобензойной кислоты, из которой в клетке микроорганизма синтезируется кофермент (Н4 - фолат - ТГФК), участвующий в биосинтезе нуклеотидов и нуклеиновых оснований. Нарушение синтеза нуклеиновых кислот приводит к нарушению синтеза жизненноважных белков и к гибели микроорганизмов.

активном центре, а в другом месте Не может быть ослаблено

или устранено повышением концентрации субстрата

E + I ↔ EI;
ES + I → ESI. 

не беспорядочны, а образуют строго определенные метаболические пути, характерные для

данной клетки. Индивидуальность клетки в большой степени определяется уникальным набором ферментов, который она генетически запрограммирована производить. Отсутствие даже одного фермента или какой-нибудь его дефект могут иметь очень серьезные отрицательные последствия для организма.

цепь: А, В, С, D - метаболиты, Е1, Е2, Е3,

Е4 - ферменты

Это позволяет каждой метаболической цепочке реакций постоянно изменяться, приспосабливаясь к меняющимся потребностям клетки в продукте.

цепочке реакций.
Он называется регуляторным ферментом. Существует несколько

способов регуляции действия ферментов:
изменение активности фермента при его постоянной концентрации;
изменение концентрации фермента, обычно в результате ускорения (индукции) или торможения (репрессии) синтеза фермента.

фосфорилирования-дефосфорилирования (путем ковалентной модификации).
Регуляция путем ассоциации-диссоциации субъединиц в олигомерном ферменте

Активация ферментов путем частичного протеолиза. 

передается посредством конформационных изменений каталитической субъединице, которая становится комплементарной субстрату,

и фермент «включается». При удалении активатора или при присоединении аллостерического ингибитора фермент переходит в неактивную форму и «выключается». Аллостерическая регуляция является основным способом регуляции метаболических путей.

ковалентной модификации.

начинается с ковалентной или нековалентной модификации одной из субъединиц.
Например,

фермент протеинкиназа в неактивной форме построена как тетрамер R2C2 (R и С - разные субъединицы). Активная протеинкиназа представляет собой субъединицу С, для освобождения которой необходима диссоциация комплекса.
Активация фермента происходит при участии цAMP (циклоаденозинмонофосфорная кислота), которая способна присоединиться к субъединице R, после чего изменяется конформация, комплементарность субъединиц R и С и происходит диссоциация комплекса:
R2C2 + 2цАМР 2С + 2(R -цАМР)
Циклический АМР является продуктом АТР, превращение которой катализирует фермент аденилатциклаза:
АТР ц АМР + Н4Р2О7

регуляторную систему.

фермента в клетке определяется соотношением скоростей его синтеза и распада. Этот способ

регуляция скорости ферментативной реакции является более медленным процессом (проявляется спустя несколько часов), чем регуляция активности фермента (практически мгновенный ответ).

количества фермента является путем длительной адаптации метаболических процессов в организме,

требует для своего осуществления часы и дни и включения генетического аппарата. Выделяют конститутивные ферменты, которые синтезируются с постоянной скоростью и адаптативные (индуцибельные) ферменты, синтез которых начинается при поступлении в организм субстратов или других регуляторов, необходимых для разблокировки соответствующих генов.

чужеродных веществ (монооксигеназы), синтез которых начинается при поступлении в организм

токсических соединений, или ферменты глюконеогенеза, синтез которых усиливается при увеличении потребности организма в глюкозе. Пусковым звеном в этих процессах чаще всего выступают сами субстраты, гормоны (стероидные), которые непосредственно регулируют активность генов, или циклические нуклеотиды (цАМФ, цГМФ), которые активируют целые ферментные каскады.

синтез ферментов Ф1, Ф2 и Ф3, участвующих в реакциях его

метаболизма (распада), через промежуточные продукты Б и В, до конечного продукта Г

- метаболиты, Е1, Е2, Е3, Е4 - ферменты
Продукт реакции

репрессирует синтез ферментов начальных этапов его образования (пример: холестерол в избытке снижает синтез ОМГ КоА редуктазы и синтеза самого эндогенного холестерола).

из клетки переходят в активную форму. Неактивный предшественник называется проферментом.

Активация профермента включает модификацию первичной структуры с одновременным изменением конформации.
Пример, трипсиноген, синтезированный в поджелудочной железе, затем в кишечнике превращается в трипсин путем удаления фрагмента с N-конца: трипсиноген энтеропептидаза трипсин + Val-(Acn) -Lys
Расщепление определенных пептидных связей «запускает» новые взаимодействия R-групп по всей молекуле, приводя к новой конформации, в которой R-группы активного центра занимают оптимальное положение для катализа.

Активация ферментов путем частичного протеолиза

отделения внутриклеточными мембранами одних процессов от других. Например: мембраны лизосом

ограничивают проникновение лизосомальних гидролаз в другие отделы клеток.

катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по физико-химическим

свойствам и локализации в тканях. Для энзимодиагностики проводят определение активности изоферментов. 
Пример: Изоферменты лактатдегидрогеназы ЛДГ.
Активность ЛДГ1 и ЛДГ2 увеличивается при инфаркте миокарда, активность ЛДГ4 и ЛДГ5 - при заболеваниях печени и скелетных мышц, активность ЛДГ3 - при заболеваниях почек и селезенки.
Пример:Изоферменты креатинкиназы КК.
В крови чаще всего исследуется форма МВ, активность этой формы увеличивается при инфаркте миокарда. При патологических состояниях выход фермента в кровь может усилиться в связи с изменением состояния мембраны клетки.

не является постоянным и изменяется в соответствии с меняющимися условиями

обитания. Изменения изоэнзимного спектра наблюдаются как при адаптации к меняющимся условиям среды, так и в ходе онтогенеза. Эмбрионы всех млекопитающих проходят стадию развития, когда митохондрии еще не готовы к окислению субстратов. В этих условиях особенно велика роль анаэробного гликолиза. На стадии эмбриона основной формой фермента является тетрамер типа М4 (ЛДГ5) . После рождения постепенно нарабатываются другие формы ЛДГ, и к периоду, соответствующему взрослому организму, устанавливается соотношение разных изоформ, типичное для каждой ткани. Пример: в почках в эмбриональном состоянии обнаружено пять изоформ фермента, в то время как во взрослом организме в почках ЛДГ представлена в основном двумя изоформами.