Слайд 2ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У БАКТЕРИЙ
ДНК = нуклеоид (бактериальная «хромосома») –
кодирует жизненно важные признаки
внехромосомные факторы наследственности:
- Плазмиды,
- Транспозоны,
- IS-последовательности
кодируют признаки, дающие преимущество.
Слайд 3
Единицей наследственности является ГЕН = участок ДНК, в котором зашифрована
последовательность аминокислот в полипептидной цепочке, контролирующая отдельный признак особи.
Слайд 4
Гены:
Структурные = обуславливают синтез определенного белка (фермента), при мутации образуется
белок измененного состава,
Ген-регулятор = определяет синтез белковой молекулы-репрессора, подавляющего деятельность
структурных генов в отсутствии субстрата,
= при наличии субстрата репрессор временно инактивируется и структурные гены, освобожденные от его влияния, начинают функционировать,
Ген-оператор = посредник между геном-регулятором и структурными генами,
= расположен рядом со структурными генами.
Слайд 5Совокупность генов, сосредоточенных в нуклеоиде («Хромосоме») бактерий называется генотип.
Фенотип –
совокупность всех признаков микроорганизма, сформировавшаяся в результате взаимодействия генотипа с
внешней средой.
Генетические элементы, способные самостоятельно реплицироваться наз-ся репликонами = ДНК и плазмиды.
Слайд 7ДНК («хромосома»)
двухцепочечная кольцевая молекула,
сод-т до 5 тыс. генов,
имеет молекулярную массу 1,7-2,8х109 дальтон,
включает 3-5х106 пар оснований,
имеет гаплоидный набор генов,
расположена в цитоплазме клетки в многократно свернутом и плотно упакованном виде,
содержит гены, обуславливающие жизненно-важные для бактерий признаки.
Слайд 8Генетическая карта
= это схематическое изображение всех генов микроорганизма.
Гены, отвечающие
за определенный признак, обозначают строчными буквами латинского алфавита со знаком
+ (например, гистидиновый ген – his+), отсутствие гена знак – «–»
Слайд 9ВНЕХРОМОСОМНЫЕ ФАКТОРЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ
автономные – являются репликоном
плазмиды
неавтономные - реплицируются только в
составе репликона (нуклеоида или плазмиды):
Транспозоны,
IS-последовательности,
умеренные фаги.
Слайд 10ВСТРАИВАНИЕ В НУКЛЕОИД ВНЕХРОМОСОМНЫХ ФАКТОРОВ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ
в гомологичных участках
Плазмиды,
Умеренные фаги.
в любых
участках
Транспозоны,
IS-последовательности.
Слайд 11ПЛАЗМИДЫ
внехромосомные факторы наследственности у бактерий,
двухцепочечные молекулы ДНК,
несут 40-50 генов,
не являются жизненно важными для бактерии,
обусловливают признаки, позволяющие лучше
приспособиться к условиям обитания.
возможные состояния
автономное (в цитоплазме)
интегрированное (в нуклеоиде). В этом случае плазмида называется ЭПИСОМА.
Слайд 12ПЛАЗМИДЫ
функции
регуляторная – компенсирует нарушение функции ДНК нуклеоида,
кодирующая – вносит в
генотип новую информацию.
содержание tra-оперона
Трансмиссивные (конъюгативные) - содержат
Нетрансмиссивные (неконъюгативные) - не
содержат
Слайд 13ПЛАЗМИДЫ
контроль репликации плазмид со стороны нуклеоида
строгий (делятся синхронно с нуклеоидом)
1-2 копии на клетку (большие плазмиды),
ослабленный (делятся чаще нуклеоида)
10-30 копий на клетку (малые плазмиды).
совместимость
20 групп несовместимости, объединяющих родственные плазмиды.
Слайд 14ФУНКЦИИ TRA-ОПЕРОНА
детерминирует образование конъюгативных пилей,
мобилизирует на перенос:
саму конъюгативную плазмиду (F+),
другую,
неконъюгативную, плазмиду (RTF),
участок нуклеоида (Hfr).
Слайд 15
Фенотипические признаки, сообщаемые бактерии плазмидами
устойчивость к антибиотикам,
образование бактериоцинов,
продукция факторов
патогенности,
способность к синтезу антибиотиков,
расщепление сложных органических веществ,
образование ферментов рестрикции и
модификации.
Слайд 16Наиболее изучены плазмиды:
F- плазмида = половой фактор – контролирует синтез
половых ворсинок,
= бывает: - автономной→ бактерия наз-ся F+ штаммом
- интегрированной → Hfr – штамм,
= конъюгативная
R-плазмида (resistance - устойчивость) – обусловливает синтез ферментов, разрушающих антибиотики, сульфаниламиды и др., в результате бактериальная клетка становится устойчивой к лекарственным препаратам,
- в 1 плазмиде м.б. 3-10 детерминант устойчивости.
Слайд 17Наиболее изучены плазмиды:
Col-плазмиды - обусловливают синтез бактериоцинов ( = белки,
задерживающие рост других штаммов бактерий того же вида). Бактерии, несущие
такие плазмиды, обладают преимуществом при заселении биотопа.
Плазмиды патогенности – определяют:
синтез энтеротоксинов (Ent-)
ферментов патогенности (Hly-),
поверхностного антигена вирулентности ( Vir-).
Плазмиды биодеградации – несут информацию об утилизации органических соединений, которые бактерии используют в качестве источника углерода и энергии.
Слайд 18ТРАНСПОЗОНЫ
определение
= нуклеотидные последовательности (от 2 000 до 20000 пар нуклеотидов),
способные менять место своей локализации в молекуле ДНК и мигрировать
из одной молекулы ДНК в другую.
состояние в бактериальной клетке
интегрированное в репликон (реплицируется вместе с ним),
автономное (замыкается в кольцо и не реплицируется).
Слайд 19ТРАНСПОЗОНЫ
Состав:
особые концевые структуры, которые отличают транспозон от др. фрагментов ДНК
(маркеры транспозона),
гены транспозиции,
гены, детерминирующие синтез
- токсинов,
- ферментов, обеспечивающих
устойчивость к антибиотику,
- белков, обеспечивающих др. признаки.
Слайд 20IS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
определение
=вставки нуклеотидных последовательностей (порядка 1 000 пар нуклеотидов),
содержат только гены,
необходимые для собственного перемещения:
= ген, кодирующий фермент транспозазу
– обеспечивает исключение IS-элемента из ДНК и его интеграцию в новый локус,
= ген, обуславливающий синтез репрессора, регулирующего весь процесс перемещения,
не способны реплицироваться самостоятельно.
Слайд 21IS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
отличия от транспозонов
содержат только гены транспозиции,
не обнаружены в свободном состоянии.
Слайд 22Функции IS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между собой и
с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации,
регуляторная - регуляция
транскрипции генов путём их «включения/выключения»,
индукция мутаций - инверсии, дупликации на протяжении 5-9 пар нуклеотидов.
Слайд 23Изменчивость микроорганизмов
Модификационная = ненаследуемая,
Генотипическая = наследуемая.
Слайд 24Изменчивость микроорганизмов
Модификационная = ненаследуемая, фенотипическая, адаптационная,
– возникает как приспособительная
реакция организма на условия среды,
- встречаются часто и
касаются одновременно всех особей популяции,
- вскоре утрачиваются.
Слайд 25МОДИФИКАЦИИ У БАКТЕРИЙ
Фенотипические изменения у бактерий
не сопровождаются изменениями первичной структуры
ДНК,
они выражаются:
- в изменении формы и размеров микробной клетки,
- морфологии колоний,
- биохимических и антигенных признаков.
Слайд 26Изменчивость микроорганизмов
Наследуемая = генотипическая
– изменения затрагивают лишь
отдельные клетки,
– приобретенные признаки передаются потомству и в
силу лучшей адаптации к условиям существования измененные клетки с новыми признаками постепенно вытесняют клетки исходного штамма.
Изменения генома могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций.
Слайд 27МУТАЦИИ У БАКТЕРИЙ
Определение
Изменения в первичной структуре ДНК, которые
выражаются в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака (-ов).
Слайд 28Классификация мутаций по происхождению
спонтанные – трудно или невозможно связать с
действием определённого фактора (мутагена)
ошибки в работе ДНК-полимеразы при репликации ДНК
инсерционные
– при встраивании в нуклеоид внехромосомных факторов наследственности
индуцированные – в эксперименте под воздействием мутагена
Слайд 29Классификация мутаций по количеству мутировавших генов:
Генные затрагивают один ген:
-
замена одной пары азотистых оснований другой,
- вставка дополнительных нуклеотидов,
- утрата
«-«→ замена одной аминокислоты другой или нонсенс-мутация = бессмысленная,
Хромосомные затрагивают несколько генов.
Важную роль играют мигрирующие генетические элементы: Is- последовательности и Tn- транспозоны = биологические мутагены.
Слайд 30Хромосомные мутации
делеции – потеря гена,
инверсия – поворот участка хромосомы
или нарушение порядка гена,
дупликации – удвоение гена,
транспозиция – перемещение
гена.
Слайд 31Классификация мутаций по направленности
прямые – потеря или изменение признака,
обратные (реверсии)
– восстановление признака:
истинные – восстанавливается и фенотип и генотип,
супрессорные –
восстанавливается только фенотип.
Слайд 32SR-ДИССОЦИАЦИИ
= появление в чистой культуре 2 видов бактериальных клеток, которые
отличаются по характеру образуемых колоний на твердой питательной среде:
S-колонии
– форма круглая, поверхность гладкая, чаще образуются при выделении от больного человека, бактериальные клетки характеризуются высокой вирулентностью,
R- колонии имеют неровные края, шероховатую поверхность.
Между ними м.б. переходные формы: О- мутные,
Д-карликовые.
Процесс диссоциации обычно протекает в одном направлении: от S- к R-.
Слайд 33SR-ДИССОЦИАЦИИ
механизм
Это инсерционная мутация, приводящая к утрате генов, контролирующих синтез полисахаридных
звеньев ЛПС наружной мембраны клеточной стенки
биологическое значение:
R-формы более устойчивы к
физико-химическим факторам внешней среды,
S-формы более устойчивы к фагоцитозу и действию антител.
Значительно усложняют выделение и идентификацию чистой культуры.
Слайд 34МУТАГЕНЫ
Мутагены – факторы, вызывающие мутации.
Различают:
физические мутагены – ультрафиолетовые лучи,
ионизирующие излучения, магнитные поля, температура,
химические – пероксидазы, акридиновые красители, азотная
кислота,
биологические – Is-последовательности и Tn- транспозоны, фаги, антибиотики, фитонциды.
Слайд 35МУТАГЕНЫ
Классификация по механизму действия:
аналоги азотистых оснований замена пар оснований,
акридиновые
красители выпадения или вставки оснований,
УФ, некоторые продукты микробного метаболизма
нарушение работы ДНК-полимеразы образование тиминовых димеров,
нитрозосоединения множественный эффект («супермутагены»).
Слайд 36РЕПАРАЦИИ
Определение
Процесс восстановления повреждённой ДНК ферментами репарационных систем
Различают 2 типа репарационных
систем:
Система фотореактивации
Система темновой репарации.
Слайд 37Система фотореактивации
УФ-лучи
мутация
тиминовые димеры
видимый свет
активация фермента репарация
расщепление димеров
Слайд 38
Этапы темновой репарации:
установление места повреждения ДНК = эндонуклеаза,
«вырезание» поврежденного фрагмента = полимераза 1,
синтез фрагмента по матрице
сохранившейся нити ДНК – ДНК-полимераза 1 или III,
встраивание синтезированного фрагмента в молекулу поврежденной нити ДНК = лигаза
Слайд 39Система темновой репарации
УФ-лучи
тиминовые димеры
темнота
Слайд 40Система темновой репарации
обнаружение и нарезание повреждённого участка
(эндонуклеаза)
Слайд 41Система темновой репарации
удаление повреждённого участка
(ДНК-полимераза I)
Слайд 42Система темновой репарации
синтез на матрице второй нити ДНК нового, не
содержащего мутации, участка
(ДНК-полимераза I или III)
Слайд 43Система темновой репарации
«вшивание» нового участка в цепь ДНК
(лигаза)
Слайд 44Генетические рекомбинации
= перераспределение генетического материала родителей в потомстве, обусловливающее комбинативную
изменчивость организмов,
= взаимодействие между двумя геномами, которое приводит к образованию
рекомбинантной ДНК и формированию дочернего генома, сочетающего гены обоих родителей.
Они происходят при участии ферментов в пределах отдельных генов.
Слайд 45Механизм рекомбинаций
клетки=доноры
передают информацию
клеткам-реципиентам
рекомбинат
генотип рекомбинанта =
генотип реципиента+ часть генотипа донора
Слайд 47ВИДЫ РЕКОМБИНАТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ У БАКТЕРИЙ
Трансформация – непосредственная передача генетического материала
от донорской к реципиентной клетке
Конъюгация – передача генетического материала от
донорской к реципиентной клетке с помощью конъюгационных пилей
Трансдукция – передача генетического материала от донорской к реципиентной клетке с помощью дефектных бактериофагов.
Слайд 48Трансформация
= способ передачи генетической информации путем внедрения свободной ДНК донора
в бактерию-реципиент
Трансформация эффективно происходит только между бактериями одного вида,
имеющими разный генотип.
Слайд 49Трансформация
Клетки, способные принимать донорскую ДНК, называются компетентными.
Состояние компетентности возникает
в период роста клетки и совпадает с концом логарифмической фазы.
Трансформирующей
активностью обладают двунитевые фрагменты ДНК с молекулярной массой не менее 0,5-1х106 .
Слайд 50
Процесс трансформации состоит из фаз:
адсорбция ДНК донора на клетке-реципиенте,
проникновение ДНК
внутрь клетки-реципиента с последующей деспирализацией,
соединение одной нити ДНК с гомологичным
участком хромосомы реципиента.
Слайд 52Конъюгация
– перенос генетического материала из клетки-донора в клетку реципиента при
тесном контакте.
Донорами генетического материала являются клетки, несущие F-плазмиду.
Бактериальные
клетки, не имеющие F-плазмиды, являются реципиентами.
Слайд 53Конъюгация
2 вида конъюгации:
Если F-плазмида автономна→ бактерия наз-ся F+ штаммом
2.Если
F-плазмида интегрирована в ДНК →
Hfr – штамм
Слайд 54
1 Если F-плазмида автономна:
1. Прикрепление клетки донора к реципиенту с
помощью половых ворсинок.
2. Между клетками образуется конъюгационный мостик, через
который из клетки-донора в клетку-реципиент передается F-плазмида:
2.1. tra-оперон кодирует белок, который в точке О разрывает одну цепь плазмиды и ковалентно связывается с 5, концом,
-2.2. линейная цепь переносится в клетку-реципиент, кольцевая нить остается в клетке-доноре,
Слайд 55Схема конъюгации у бактерий (если F-плазмида автономна)
Слайд 56
1 Если F-плазмида автономна:
2.3. белок способствует
замыканию линейной нити в клетке-реципиенте,
2.4. одноцепочечные нити достраиваются
до двухцепочечных в клетке-доноре и реципиенте.
→ реципиент становится донором!!!
Слайд 57Схема конъюгации у бактерий (если F-плазмида автономна)
Слайд 58
2.Если F-плазмида встроена в хромосому бактерии = Hfr-штамм:
Происходит разрыв
одной нити ДНК при участии эндонуклеазы в точке О, расположенной
в месте интеграции F-плазмиды.
Проксимальный конец ДНК через конъюгационный мостик проникает в клетку-реципиент и сразу же достраивается до двунитевой структуры.
Оставшаяся в клетке донора нить является матрицей для синтеза второй нити.
- передается не вся нить, а несколько генов, плазмида остается в донорской клетке → реципиент остается реципиентом
Слайд 60Схема конъюгации Hfr-штамма
разрыв одной нити ДНК при участии эндонуклеазы
в точке О, расположенной в месте интеграции F-плазмиды.
Слайд 61Схема конъюгации Hfr-штамма
Проксимальный конец ДНК через конъюгационный мостик проникает
в клетку-реципиент и сразу же достраивается до двунитевой структуры.
Слайд 62Схема конъюгации Hfr-штамма
Двунитевой фрагмент ДНК встраивается в геном клетки-реципиента;
Плазмида
осталась в клетке-доноре (Hfr-штамм)
Слайд 63
Трансдукция
– передача генетического материала от одной бактерии к
другой при помощи фагов.
Различают:
1) общую = неспецифическую трансдукцию
2)
специфическую трансдукцию
3) абортивную
Слайд 64Общая = неспецифическая трансдукция
– когда в клетку–реципиент вместе с фаговой
ДНК переносится любой ген донора.
При репродукции фага в клетке
любой случайный ген м.б. включен в состав фаговой частицы.
Перенесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора способен включаться в гомологичную область ДНК клетки-реципиента путем рекомбинации.
Трансдуцирующий фаг является только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим, а сама фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов,
Слайд 65Специфическая трансдукция
– фаг переносит специфические гены от бактерии-донора к бактерии-реципиенту:
При выходе из ДНК лизогенной клетки-донора профаг включает расположенные рядом
гены, а часть генов профага остается в хромосоме бактерии → образуется дефектный трансдуцирующий фаг.
При взаимодействии трансдуцирующих фагов с клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента.
Слайд 66Абортивная трансдукция
= принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в
хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в
таком виде функционировать.
Во время деления бактериальной клетки-рекомбинанта принесенный фрагмент ДНК донора передается только одной из дочерних клеток и со временем исчезает.
Слайд 67
Генетическая рекомбинация
= обмен между гомологичными участками геномов двух вирусов,
–
чаще встречается у ДНК-содержащих вирусов,
- среди РНК – у вирусов
с фрагментированным геномом.
вирус 1 + вирус 2 в одной клетке
вирус 1 гены вирус 2
Слайд 68
Генетическая реактивация
= обмен между геномами родственных вирусов, у которых мутации
произошли в разных генах → полноценный геном
вирус 1 + вирус
2 в одной клетке
вирус 1 вирус 2
(инакт. гены 1, 2, 3) (инакт. гены 4, 5, 6)
вирус
(все гены 1 – 6 активированы)
Слайд 69
Комплементация = обмен, когда один из двух вирусов в результате
мутации синтезирует неполноценный белок.
Немутантный вирус восполняет его отсутствие у
мутанта, синтезируя полноценный белок.
Н-р, при культивировании аденовируса в клетках почек обезьян макака-резус аденовирус мог размножаться только в присутствии онкогенного вируса SV40
вирус 1 + вирус 2 в одной клетке
вирус 1
белок
репродукция вируса 2
Слайд 70Фенотипическое смешивание
при смешанном заражении двумя вирусами часть потомства приобретает фенотипические
признаки, присущие обоим вирусам при неизменности генотипа
Н-р, при заражении клеток
вирусами полиомиелита и Коксаки часть потомства имеет РНК одного вириона заключенную в капсид другого
Слайд 71Фенотипическое смешивание
вирус 1 + вирус 2 в одной клетке
вирус 1
вирус 2
НК 1
капсид 2
Слайд 72ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
Продукты, получаемые генно-инженерным способом с помощью
рекомбинантных штаммов бактерий
вакцины
гормоны
интерфероны
цитокины
Слайд 73ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
Получение рекомбинантной вакцины для профилактики гепатита
В
встраивание гена вируса гепатита В, детерминирующего синтез HBs-Ag в геном
дрожжевой клетки
манифестация гена
синтез дрожжевой клеткой HBs-Ag
очистка HBs-Ag
вакцина, содержащая HBs-Ag, но не содержащая вирусных частиц или их фрагментов
Слайд 74ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ
процентное содержание Г+Ц в бактериальном
геноме
метод молекулярной гибридизации
полимеразная цепная реакция (ПЦР)
рестрикционный анализ
Слайд 75МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
Цель
Выявления степени сходства различных ДНК (при идентификации микроорганизмов
– сравнение ДНК выделенного штамма с ДНК эталонного штамма)
Слайд 76МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
Принцип осуществления
исследуемая ДНК
нагрев в щелочной среде
расплетение на две
отдельные нити
закрепление одной из них на специальном фильтре
помещение этого фильтра
в р-р, содержащий радиоактивный зонд (одноцепочечную молекулу ДНК эталонного штамма, меченную радиоактивным изотопом)
понижение температуры
+ - восстановление двойной спирали
– - двойная спираль не восстанавливается
Слайд 77ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Цели
обнаружение в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без
выделения чистой культуры
идентификация микроорганизмов
генотипирование микроорганизмов
Слайд 78ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Принцип осуществления
патологический материал или штамм микроорганизма
выделение ДНК
нагрев
расплетение ДНК
на две нити
добавление праймеров (участки ДНК, комплементарные 3’-концам искомого
гена)
охлаждение
связывание праймеров с комплементарными участками искомого гена
Слайд 79ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Принцип осуществления
добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов
нуклеотиды присоединяются к 3’-концам
праймеров
повторение циклов (30-80) – накопление (амплификация) искомого гена
резкое нарастание (двукратное
после каждого цикла) количества искомого гена
определение количества ДНК с помощью электрофореза
+ - количество ДНК увеличивается
– - количество ДНК не увеличивается
Слайд 80При нагревании две комплементарные нити ДНК расходятся – она плавится
Слайд 82Рестрикционный анализ
Расщепление ДНК микроорганизмов на фрагменты при помощи рестриктаз (эндонуклеаз),
От
бактерий выделено 175 рестриктаз,
Известно 80 сайтов, где происходит разрыв,
В ДНК
микроорганизма содержится определенное количество участков узнавания,
Под действием рестриктаз образуется конкретное количество фрагментов ДНК разного размера = РЕСТРИКЦИОННАЯ КАРТА
