ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ

генной инженерии и способы получения генов 2. Степень безопасности трансгенных продуктов.
3.Практические

аспекты генной инженерии

молекулярное клонирование) - это совокупность экспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос

генетического материала из одного организма в другой.
Генная инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или как создание искусственных генетических программ.
Генная инженерия – управление генетической основой организмов посредством внедрения или удаления специфических генов, с использованием техники современной молекулярной биологии.
Задача конструировать рекомбинантные ДНК, которые могли бы придать клеткам-реципиентам полезные для человека свойства (синтезировать пищевой и кормовой белок).

между различными плазмидами и фагами, иначе говоря, конструированием так называемых

векторных молекул.
Плазмиды – автономно реплицирующиеся небольшие, чаще кольцевые молекулы ДНК, содержащие сразу несколько сайтов рестрикции для разных рестрикционных ферментов.
Фаг – вирусная ДНК, паразитирующая в клетках микроорганизмов.
2. Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинатных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.
3. Третий этап связан с началом работ по включению в векторные молекулы ДНК генов эукариот, главным образом, растений и животных.

ДНК. Ферменты, которые в настоящее время применяются для конструирования рекомбинантных

ДНК, можно разделить на следующие группы:
• Ферменты, осуществляющие фрагментацию ДНК (рестриктазы).
• Фермент, синтезирующий фрагменты ДНК на матрице РНК: РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза).
• Ферменты, сшивающие фрагменты ДНК: ДНК-лигаза (полинуклеотидлигаза).
• Ферменты, позволяющие осуществлять изменение структуры концов фрагментов ДНК: нуклеаза.
• Ферменты, применяемые для приготовления гибридизационных проб: ДНК-полимераза.

молекулах.
2.1.Секвенирование обрыва цепи
2.2.Секвенирование химическим расщеплением
3. МЕТОД. химического

и химико-энзиматического синтеза дезоксиполинуклеотидов.

полинуклеотидфосфорилаз,
б) матрица мРНК с затравкой с 3' конца для

комплементарной цепи ДНК.
3. Ферментативный синтез

конструкции. На этом этапе производится встраивание нужного фрагмента ДНК (вставки)

в другую молекулу ДНК (вектор). Для выделения, анализа и конструирования генов используют клетки прокариот.
3. Введение ДНК в клетку-хозяина. Получившуюся молекулу рекомбинантной ДНК вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется (размножается) либо самостоятельно, либо интегрируется в хромосому и передается потомкам.

селективной среде, на которой могут вырасти только трансформированные клетки.
5.

Анализ экспрессии (встраивания)перенесенного гена в ДНК-клетку хозяина. Получение специфического белкового продукта, синтезирующегося клетками-хозяевами, служит подтверждением их трансгенной природы.
С момента введения рекомбинантной ДНК в клетку начинается молекулярное клонирование, т.е. получение потомков созданной рекомбинантной ДНК.

насекомым вредителям.
Устойчивость к гербицидам и насекомым.
Устойчивость к вирусам.

Устойчивость к грибным болезням.
Устойчивость одновременно к бактериальной и грибной инфекции.
Устойчивость к абиотическим факторам.
Создание трансгенных растений для фармакологической промышленности.
Выращивание растений с определенным аминокислотным составом.
Создание трансгенных растений, несущих гены, кодирующие синтез вакцин, против многих болезней.
Применение трансгенных растений для фитомедиации – очистки почв, вод от чужеродных загрязнений.

определенную последовательность своей ДНК и расщепляют чужую на мелкие фрагменты.

2. Сшивка фрагментов идет тремя методами в зависимости от видов концов.
А) Сшивка по одноименным «липким» концам – любые два фрагмента могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов.
Б) Сшивка по «тупым» концам – реже используется.
В) Сшивка фрагментов с разноименными «липкими» концами проводят с использование «переходников» - линкеров.
Линкеры – химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции (места расщипления) или их комбинацию.
3. Сшитую ДНК в пробирке вносят в живую клетку при помощи векторов разными способами.
Векторы (векторные молекулы) – молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и обеспечивающие ее репликацию и даже экспрессию.
Экспрессия гена – проявление генетической информации, записанной в гене, в форме РНК, белка и фенотипического признака.
В качестве векторов используют плазмиды (кольцевые внехромосомные ДНК, автономно реплицирующиеся) и бактериофаги – вирусы, инфицирующие бактерии.
3.1. Использование промежуточного вектора
3.2. Метод биологической баллистики для трансформации однодольных.

методами (микроинъекция, электропорация, слияние липосом), либо при помощи вирусных векторов.
Стратегия

получения трансгенных животных состоит в следующем:
1. Клонированный ген в составе вектора вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки.
2. Инокулированные оплодотворенные яйцеклетки имплантируют в реципиентную женскую особь.
3. Отбирают потомков, которые содержат клонированный ген во всех клетках.
4. Скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках зародышевой линии, и получают новую генетическую линию.
Основные схемы получения трансгенных животных.
1. Вектором на основе ретровируса животных инфицируют восьмимиклеточный эмбрион, который потом имплантируется в самку. Этот способ трансформации считается наиболее эффективным.
2. Трансгенную конструкцию вводят путем микроинъекции в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки, которая затем переносится в «суррогатную мать».
3. Стволовые клетки модифицируются в культуре, после чего их вводят в эмбрион на стадии бластоцисты.
4. Перенос гена осуществляют при помощи дрожжевых хромосом (YAC), что позволяет переносить несколько генов вместе с их собственными регуляторными последовательностями.

конструкции в пронуклеус яйцеклетки; 6 - набухание пронуклеуса после инъекции

складывается из 2 направлений:
исследование биобезопасности организмов.
определение пищевой безопасности трансгенных организмов.

для окружающей среды и для человека связана с возможными отрицательными

последствиями:
вытеснением природных организмов из их экологических ниш с последующим нарушением экологического равновесия,
уменьшение биоразнообразия,
бесконтрольный перенос чужеродных генов из трансгенных организмов в природные, что может привести к активации ранее известных или образованию новых патогенов.

опасности штамма.
2. Исследование поведения микроорганизма в изолированной теплице или изолированном

водоеме.
3. Проведение мелкоделяночных полевых испытаний.
Крупномасштабные полевые испытания.
Крупномасштабная интродукция трансгенного организма.

продукта,
норм потребления,
способов использования в питании,
поступления отдельных нутриентов (если ожидаемое поступление

нутриента превышает 15% от его суточной потребности),
влияние на микрофлору кишечника (если содержит живые организмы).

тракте (в случае содержания живых организмов),
результаты субхронического (90 суток) токсикологического

эксперимента на лабораторных животных и исследований на добровольцах.

растительный геном, в том числе маркерных генов, промоторов, оценку регуляторных

последовательностей, определение стабильности генетически модифицированных организмов на протяжении нескольких поколений с учетом уровня выраженности генов.
Медико-биологическая оценка – определение санитарно-химических показателей качества и безопасности, проведения токсикологических исследований на лабораторных животных, оценки аллергенных свойств, возможных мутагенных и канцерогенных эффектов продукта, изучения влияния на функцию воспроизводства, наблюдений на добровольцах и эпидемиологических исследований.
Исследования технологических свойств – определение ее органолептических и физико-химических свойств, изучения сохранности и влияния генетической модификации на технологические параметры продукции.