Иммунохимические методы. ИФА – иммуноферментный анализ

биологии,
Д.м.н. Спирина Людмила Викторовна

с соответствующими антителами.

60-х годов для идентификации и локализации антигенов в качестве высокочувствительной

метки было предложено использовать молекулы ферментов.
На протяжении последних трех десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане.

РИА

Иммунные методы

иммунодиффузия

иммуноэлектрофорез

Твердофазный ИФА

данном случае исследование называют иммуноферментным анализом (ИФА), его разновидность -

анализ иммуноферментно-флюоресцентный.
3. Флюоресцирующие, люминесцирующие вещества и др.

Индикация образующегося комплекса антиген-антитело может быть осуществлена, различными методами.

количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе

которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

на каждой из
иммунохимических стадий реакций
Гомогенно-гетерогенные

прямой
непрямой

стандартно штампованных микроплашек с 96 или 60 лунками (или шарики,

колпачки и прочее - для постановки единичных проб);

Белки хорошо сорбируются на подобранных для ИФА пластмассовых материалах.
Все остальные реагенты тест-систем используют в виде растворов.
Результат реакции «остается» на твердой фазе и регистрируется количественно.

на связи с ферментами.

В основе гомогенного ИФА лежит ингибирование

активности фермента при его соединении с антигеном и восстановление ее в результате реакции антиген – антитело или же, наоборот, потеря активности фермента в результате реакции.
Существенным достоинством гомогенного ИФА является экспрессность определения, которая составляет 2 – 5 минут.
К недостаткам следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (~ 1 мкг/мл).

E

+

E

вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки

носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов.
Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.

Принцип - иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела + меченый ферментом и немеченый антиген конкуриру-ют за связь с антителом.

ХОД РЕАКЦИИ

антитела как реагент конъюгированы с ферментом.
Определяемый антиген в испытуемой

пробе конкурирует с
иммобилизованным на твердой фазе антигеном за растворимые антитела.
В итоге ферментативная активность, измеряемая на твердой фазе, обратно
пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе.

конкурентный

ингибиторный

содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется комплекс антиген-антитело.
Добавляют

меченные ферментом специфические антитела.
Ферментативная  реакция –при добавлении субстрата
Определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило

поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод.
метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, Сэндвич по крайней мере, две антигенные детерминанты.

от конкурентных и ингибиторных методик, поскольку чистые антигены всегда труднодоступны

и дороги.
Чувствительность «сэндвич»-ИФА потенциально выше, чем конкурентных и ингибиторных.
Аналогичная технология применима и с использованием одного антитела (и на твердой фазе, и в составе конъюгата с ферментом) в случаях наличия на заданном антигене повторяющихся эпитопов.
В современных модификациях ту же технологию называют ловушечным ИФА (capture IA) - антитела на твердой фазе «ловят» свой антиген из смеси веществ в биопробе.

«сэндвич»-метод -пример неконкурентного ИФА

определяемый антиген, вносят заведомый избыток меченых антител. Затем к этой

смеси добавляют также заведомый избыток иммобилизованного на мелкодисперсной твердой фазе антигена.

После инкубации центрифугированием отделяют растворимую фракцию (супернатант) и в ней измеряют ферментативную активность (если метка - фермент).

к антителу против целевого антигена, а к так называемым вторым

антителам - антивидовым антииммуноглобулиновым антителам, т.е. антителам к иммуноглобулинам того вида животных или человека, с биологическим материалом которого работают.

антител
Вместо антивидовых антиглобулиновых антител для конъюгации с ферментом может быть

использован, например, протеин А стафилококка, который по своей природе с высокой аффинностью связывается с иммуноглобулинами класса G некоторых видов млекопитающих, включая человека.

иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.
ХОД РЕАКЦИИ



На поверхности носителя иммобилизуют

антиген-белок
добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют.
добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител (вторичных).
детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов,
причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена

ферментных конъюгатов,
а также возможное влияние компонентов
образца на активность

фермента.

Даёт возможность выявлять антитела
к разным антигенам.
Анализируемый образец и
меченый реагент вводятся в систему
на разных стадиях,
что устраняет влияние различных эффекторов,

Применение универсального реагента 
— меченых антивидовых антител усложняет
анализ проведение из-за введения
дополнительных стадий.

ПРЯМОЙ ИФА

НЕПРЯМОЙ ИФА

Преимущества и недостатки

преимущество

недостатки

(продукт желто-коричневый, растворимый, поглощает при 492 нм);•  3,3'-диаминобензидин (продукт коричневый,

нерастворимый); •  3-амино-9-этилкарбазол (продукт красный; нерастворимый); •  
β-Галактозидаза (субстраты - дериваты β-галактозида, например 4-метилумбелиферил-β-D-галактозин).
Щелочная фосфатаза (субстраты: 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат в комбинации с голубым тетразолиевым, продукт голубой, нерастворимый; р-нитрофенил фосфат, продукт желтый, растворимый, поглощает при 405 нм).
Уреаза (субстрат - мочевина в комбинации с бромкрезолом пурпурным, продукт образуется очень быстро, пурпурного цвета, растворимый, поглощает при 590 нм).

(лизированный или обработанный
ультразвуком возбудитель инфекции,
полученный в культуре
Рекомбинантные —
полученные генно-инженерным

способом
белки-аналоги белковых антигенов возбудителя;

Пептидные 
— использующие химически
синтезированные фрагменты белков.

Общее направление развития ИФА-диагностикумов —
это направление от лизатных
тест-систем, которые принято называть
тест-системами первого поколения,
к рекомбинантным и пептидным.

или интересующее антитело не удается конъюгировать с меткой без существенных

потерь в аффинности их связывания, то в конструкцию тест-системы пробуют вводить дополнительные компоненты.
Авидин - белок, выделяемый из «белка» куриных яиц, биотин - витамин Н (он же кофермент R). Авидин по своей природе с высокой аффинностью (Kd ~ 10-15 M) связывает биотин.
Биотин легко конъюгируется с флюоресцеином. Кроме того, и против авидина, и против биотина получены высокоаффинные моноклональные антитела.
Сходным по аффинности сродством к биотину обладает также белок стрептавидин, выделяемый из грибов Streptomyces avidinii.

метода ИФА (более 90%). 2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики

процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках. 3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Относительный недостаток:
Выявление иммунного ответа (антител), но не самого возбудителя.

Оборудование: ИФА-ридер, шейкер, промыватель

антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических); 3) исследование гормонального статуса пациента; 4) обследование

на онкомаркеры; 5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

заменяемыми методами исследования
ИФА-анализ основан на выявлении не самой инфекции, а ее продуктов жизнедеятельности — белов-маркеров.

ПЦР-анализ напротив выявляет существующие в настоящее время инфекционные агенты (бактерии, вирусы, грибы).
Случается, что результаты ПЦР и ИФА-диагностики могут не совпадать. Обычно это происходит вследствие нескольких причин:
«Иммунологический след» — «след» от уже перенесенной инфекции. 
Разница в используемых тест-системах для проведения диагностики (в ПЦР – определение определенного вида бактерий, а ИФА – определение антител вне зависимости от вида инфекции)

инфекции. Для ИФА-диагностики разницы в месте нет, поскольку ИФА «реагирует» на

антитела, которые вырабатываются при инфекционном процессе любой локализации.
Хронические инфекционные заболевания могут стать причиной разницы в результатах ИФА и ПЦР-диагностики. При этом зачастую ПЦР дает положительный, а ИФА — отрицательный результат. 1. Уставшая от хронического инфекционного процесса иммунная система может «не показать» повышенный уровень антител к инфекции.
2. В случае «свежей» инфекции до 2 недель. ПЦР дает положительный, а ИФА — отрицательный результат.

Разница между ПЦР и ИФА. ПЦР или ИФА не являются заменяемыми методами исследования

собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека;
за счёт

антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов;
у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери.
Помимо этого, причиной ложнопололожительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества — суперантигены — неспецифически стимулируют выработку B-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям. 

могут быть обусловлены состояниями иммунодефицита,
а также техническими ошибками при постановке реакции.

ложноположительные

ложноотрицательные

чрезмерно высоких концентрациях вещества, с которым идет реакция, результат реакции

может быть неверным - показывать неправдоподобно низкий уровень..

Любой положительный результат ИФА проверяется иммуноблотом (золотой стандарт).

от назначения анализа клиницистом до поступления исследуемого образца в лабораторию

на рабочее место, а именно: назначение анализа, отбор биологического материала, его обработку и доставку в лабораторию.
- Аналитический доприборный этап представляет собой все стадии ручного или полуавтоматического анализа до момента регистрации результатов.
- Приборный этап обычно является стадией регистрации результатов, но может также включать все процедуры, которые происходят с пробой при проведении автоматических видов анализа.
- Постаналитический этап состоит из оформления бланка с результатами, интерпретации результатов лабораторного исследования, доведения результатов до лечащего врача и постановки диагноза. На постаналитическом этапе возможным источником ошибок может являться неправильное заполнение бланка с результатами, а также неверная трактовка полученных данных.

контрактильного аппарата поперечно-полосатых мышц, позволяющий мышечным волокнам актина и миозина

скользить относительно друг друга. 

групп высокого коронарного риска среди больных острым коронарным синдромом без

подъема сегмента ST,
выделение больных, получающих наибольший эффект от низкомолекулярных гепаринов.

Экспресс диагностика

ИФА набор

работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования

иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

при реакции антиген–антитело.


Спинномозговая жидкость
сыворотка
моча

к большинству полуавтоматических и автоматических биохимических анализаторов.

С-реактивный белок
(сыворотка, моча)
Гликированный гемоглобин
Альбумин

в моче
Церулоплазмин
Ревматоидный фактор
Миоглобин
ферритин

– прозона.

антител. 
Только этот восходящий участок кривой доза-эффект используется в качестве калибровочного графика.

Калибровочная кривая строится:
для каждого индивидуального белка,
для каждого прибора,
при любом изменении условий регистрации и
периодически по мере проведения исследований.
 

обычно требуется 3–5 стандартных растворов антигена (определяемого белка). В настоящее

время используются калибраторы (стандарты) с разным уровнем концентрации аналита, определенного точным (лучше референсным) методом. Для каждой концентрации согласно методике определения проводят три параллельных исследования, в которых определяют оптическую плотность в каждой калибровочной пробе.

искомых веществ и основанный на обработке срезов специфическими антителами к нему.
антитела
с

флуоресцентным красителем
(родамин, флуоресцеин)

с ферментами (щелочная фосфатаза, 
пероксидаза хрена)

тканей
Водяные бани для депарафинизации препаратов и демаркировки антигенов при иммуногистохимическом

методе исследования
Автоматические системы для выполнения денатурации и гибридизации

цитологических, цитогенетических и новейших молекулярных методов.
Объектом исследования - уникальные

нуклеотидные последовательности конкретной хромосомы или ее отдельного участка.

Используются зонды, которые являются комплементарными по отношению к последовательностям ДНК, представляющим объект изучения.
Они помечены флуоресцентной меткой, позволяют видеть локализацию интересующих генов в составе ДНК или хромосом.

и, как следствие, при одном исследовании можно определить наличие или

число копий только этого участка (или нескольких при использовании многоцветных зондов).

Применение в клинической практике.

лабораторная генетика (оценка грубых хромосомных аномалий)
в онкологии оценка статуса рецепторов Her2neu