Слайд 1Лекция 8
Количественный хроматографический анализ
Слайд 2Основные количественные параметры хроматографических пиков
1. Площадь пика (A/S)
Участок выходной хроматографической
кривой, ограниченный контуром AEKFB и продолжением нулевой линии АВ
2. Высота
пика (h)
Отрезок WK, отвечающий максимальной амплитуде сигнала детектора
Для тех случаев, когда ширина пика изменяется пропорционально времени удерживания
3. Произведение высот пиков на время удерживания (h•tR)
Слайд 3Вспомогательные количественные параметры хроматографических пиков
1. Высота пика (h’)
Высота треугольника CLD,
образуемого касательными к ветвям пика в точках перегиба
2. Ширина пика
у основания (μВ)
3. Ширина пика на половине высоты (полуширина пика) (μ0.5)
Отрезок CD, отсекаемый на продолжении базовой линии касательными к ветвям пика
Определяется как расстояние между ветвями пика на заданном сечении высоты (на половине высоты)
Слайд 4Выбор основных количественных параметров хроматографических пиков
1. Свойства детектора
Концентрационный детектор
Потоковый детектор
W
– скорость движения ПФ
W1 < W2 < W3
Изменение расхода ПФ
приводит к изменению площадей пиков
С повышением скорости ПФ площадь пика не изменяется, а высота увеличивается
Слайд 52. Температура колонки
Выбор основных количественных параметров хроматографических пиков
Измерение площадей пиков
Мало
проявляется
Измерение высот пиков
Сильно проявляется
Нельзя использовать высоты в качестве количественных параметров
хроматографического пика в режиме программирования температуры
Слайд 6Выбор основных количественных параметров хроматографических пиков
3. Природа, состав и количество
НФ
Колонки истощаются вследствие уноса НФ. Интенсивность уноса зависит от упругости
паров НФ при рабочей температуре колонки и от жесткости задаваемого температурного режима.
За 2000 ч работы улетучивается 50 % общей массы НФ
За 1 день – унос около 0.2 % НФ
Высота пиков будет увеличиваться на 0.2 % в день
Прогрессирующее завышение результатов
Слайд 7Выбор основных количественных параметров хроматографических пиков
Вопрос о предпочтительном использовании при
количественной расшифровке хроматограмм высот пиков, площадей или произведения высоты на
время удерживания должен решать сам хроматографист после тщательного всестороннего анализа аппаратурных возможностей, вида хроматограмм и допустимой погрешности определения
Слайд 8Методы количественного анализа
Первостепенная задача: градуировка прибора, т.е. установление строгой числовой
зависимости между сигналом детектора и количеством определяемого вещества.
Суть метода
Использование
зависимости одного из количественных параметров хроматографического пика (S, h, h•tR) от содержания вещества в пробе
Слайд 9Варианты расчета
Методы количественного анализа.
Метод абсолютной градуировки
1. По градуировочному графику
1 –
линейно работающий хроматограф
2 – нелинейно работающий хроматограф
Сi – массовое или
объёмное содержание i-го вещества в пробе (в %) или его абсолютное количество (в см3, мкл, мкг)
2. По уравнению градуировочного графика
3. Сравнение с одним эталоном (по пропорции)
Слайд 10Методы количественного анализа
Метод абсолютной градуировки
4. С применением калибровочных коэффициентов
qi
- масса
компонента
Ri
- параметр пика (S, h, h•tR)
Содержание компонента в пробе рассчитывают
как
ki
- усредненное значение калибровочного коэффициента
Q
- масса пробы, введенной в колонку
Слайд 11Методы количественного анализа
Метод абсолютной градуировки
Методика проведения анализа
Готовят модельные смеси тех
компонентов, содержание которых необходимо определить в контрольной пробе.
Хроматографируют модельную смесь:
если
смесь одна, то меняют объём пробы;
если объём пробы постоянен, то используют несколько смесей с различной концентрацией компонентов.
3. Рассчитывают калибровочные коэффициенты для определяемых компонентов.
4. Хроматографируют контрольную пробу.
5. Рассчитывают содержание компонентов в контрольной пробе.
Слайд 12Методы количественного анализа
Метод абсолютной градуировки
Недостатки метода абсолютной градуировки
Необходимость точной и
воспроизводимой дозировки пробы.
Строгое соблюдение постоянства условий хроматографирования при градуировке прибора
и при анализе контрольной пробы.
Высокая степень чистоты реагентов и растворителей, используемых для приготовления модельных смесей.
Концентрации компонентов в модельных смесях должны перекрывать ожидаемую концентрацию в контрольной смеси.
Слайд 13Область применения
Если есть сомнения в линейной работе детектора.
При анализе примесей,
т.е. когда надо определить не все компоненты смеси.
Методы количественного
анализа
Метод абсолютной градуировки
Слайд 14Методы количественного анализа
Метод внутренней нормализации
Суть метода
Заключается в отнесении измеренного параметра
хроматографического пика (S, h, h•tR) к суммарному сигналу детектора на
все компоненты пробы, присутствующие в образце.
Слайд 151. Простая нормализация
Варианты расчета
Методы количественного анализа
Метод внутренней нормализации
Концентрация компонентов рассчитывается
как относительная площадь:
Условия:
регистрация всех компонентов пробы
одинаковая чувствительность детектора к разным
веществам (если молекулярная масса веществ близка).
Слайд 162. Основной вариант
Методы количественного анализа
Метод внутренней нормализации
Ki – калибровочный коэффициент.
Его рассчитывают как:
ст – это стандартный компонент, элюируемый первым
Слайд 17Методика проведения анализа
Готовят модельную смесь компонентов идентичного качественного состава, что
и контрольная смесь.
Хроматографируют модельную смесь, определяют калибровочные коэффициенты.
Хроматографируют контрольную смесь
с неизвестным количественным составом компонентов.
Вычисляют концентрации компонентов в контрольной смеси.
Методы количественного анализа
Метод внутренней нормализации
Слайд 18Методы количественного анализа
Метод внутренней нормализации
Недостатки метода внутренней нормализации
Трудность разделения всех
компонентов сложной смеси.
Необходимость идентификации всех компонентов смеси.
Трудоёмкость определения всех калибровочных
коэффициентов.
Погрешности как на стадии хроматографирования, так и на стадии приготовления модельных смесей.
Взаимозависимость точности определения одного компонента от точности определения всех компонентов, присутствующих в смеси.
Необходимость линейного детектирования.
Слайд 19Преимущества метода внутренней нормализации
Методы количественного анализа
Метод внутренней нормализации
Нет необходимости в
точном дозировании образца.
Нет необходимости в соблюдении тождественности условий анализа при
повторных определениях.
Область применения
Рутиный анализ малокомпонентных смесей.
Для проведения приблизительных расчетов.
Слайд 20Методы количественного анализа
Метод внутреннего стандарта
Суть метода
Заключается в прибавлении к известному
количеству анализируемого образца известного количества не содержащегося в нём эталонного
соединения (внутреннего стандарта) и последующем хроматографировании приготовленной смеси.
Ri , Rст
– параметры хроматографических пиков определяемого и стандартного вещества
Ki – калибровочный коэффициент
qст, qсм
– количество стандартного вещества и анализируемой смеси (мг, мкл, ммоль)
Слайд 21Методы количественного анализа
Метод внутреннего стандарта
Методика проведения анализа
Получают хроматограммы пробы и
стандартного вещества.
Составляют смеси из определяемого и стандартного веществ.
Хроматографируют смеси, определяют
калибровочные коэффициенты:
4. К точной навеске пробы прибавляют точную навеску внутреннего стандарта, хроматографируют смесь.
5. Определяют содержание определяемого вещества.
Слайд 22Методы количественного анализа
Метод внутреннего стандарта
Требования к внутреннему стандарту
Полная смешиваемость с
компонентами анализируемой смеси.
Химическая инертность по отношению к компонентам пробы, ПФ,
НФ, адсорбенту.
Близость по структуре и молекулярной массе к анализируемому компоненту.
Концентрацию стандарта подбирают таким образом, чтобы Rст / Ri ≈ 1
Близость к пику определяемого соединения на хроматограмме.
Отсутствие таких примесей, пики которых накладывались бы на пики определяемого компонента.
Слайд 23Методы количественного анализа
Метод внутреннего стандарта
Недостатки метода внутреннего стандарта
Необходимость в специальной
подготовке пробы для анализа.
Трудности при выборе стандарта.
Преимущества метода внутреннего стандарта
Минимум
погрешности из-за случайных изменений параметров хроматографического опыта.
Нет необходимости в точном дозировании пробы и соблюдении всех переменных параметров хроматографирования.
Важно, чтобы стандарт и анализируемое соединение разделялись на хроматограмме. Остальные компоненты могут разделяться не полностью.
Нет необходимости в предварительной идентификации веществ.
Слайд 24Методы количественного анализа
Метод внутреннего стандарта
Область применения
При анализе некоторых компонентов смеси.
При
использовании селективных детекторов (когда не все компоненты регистрируются).
Когда компоненты пробы
частично испаряются.
При анализе жидкостей.
Слайд 25Методы количественного анализа
Метод стандартной добавки
Суть метода
В качестве стандарта используют соединения,
содержащиеся в смеси, или даже сам определяемый компонент.
Методика проведения анализа
В
одинаковых условиях получают две серии хроматограмм:
исходной анализируемой смеси
порции смеси с добавленным к ней известным количеством одного из компонентов, играющего роль стандартного соединения
определяют содержание компонентов
Слайд 26Методы количественного анализа
Метод стандартной добавки
К нескольким одинаковым навескам анализируемой смеси
добавляют известные последовательно увеличиваемые количества определяемого вещества.
Слайд 27Методы количественного анализа
Метод стандартной добавки
Недостатки
Необходима линейная работа детектора.
Необходим стабильный режим
работы всех систем хроматографа.
Возрастающая продолжительность проведения анализов.
Преимущества
Большая точность.
Простота выполнения.
Не требует
знания калибровочных коэффициентов.
Область применения
В случае, если выбор вещества-стандарта затруднён.